ビオチン - ストレプトアビジンの相互作用とペプチド核酸酸鎖ハイブリダイゼーションに基づくタンパク質親和性精製のためのペプチド核酸プローブ

ビオチンのストレプトアビジンの高い親和性を活用するが、タンパク質検索のためにビオチン - スレプトアビジン複合体の解離を必要としないタンパク質親和性精製の新しい方法について説明します。従来の試薬は、選択的に反応するグループ（「弾頭」）とビオチンの両方を同じ分子に配置します。弾頭とビオチンを別々の分子に置き、それぞれがDNAと同じ塩基を使用しているが、プロテアーゼやヌクレアーゼによる攻撃に耐性のある骨格に付着する合成ポリマーの短いペプチド核酸（PNA）にリンクします。DNAのように、相補的な塩基配列を持つPNA鎖がハイブリダイズします。PNAデュプレックス形成を支持する条件では、弾頭鎖（タグ付きタンパク質を運ぶ）とビオチン鎖は、固定化されたストレプトアビジンに保持される複合体を形成します。DNAと同様に、PNA二重鎖は中程度に上昇した温度で解離します。したがって、タグ付けされたタンパク質の検索は、熱への短い暴露によって達成されます。ヨードアセテートは、弾頭、8塩基PNA鎖、ビオチン、およびストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズとして、システインプロテアーゼパパインの回収を示します。また、チオール還元酵素とグルタチオーゼトランスフェラーゼを大豆苗木子葉から回収して同定するために、ヨードアセチル-PNA：PNA-ビオチンプローブを使用することもできました。

We describe a new method for protein affinity purification that capitalizes on the high affinity of streptavidin for biotin but does not require dissociation of the biotin-streptavidin complex for protein retrieval. Conventional reagents place both the selectively reacting group (the "warhead") and the biotin on the same molecule. We place the warhead and the biotin on separate molecules, each linked to a short strand of peptide nucleic acid (PNA), synthetic polymers that use the same bases as DNA but attached to a backbone that is resistant to attack by proteases and nucleases. As in DNA, PNA strands with complementary base sequences hybridize. In conditions that favor PNA duplex formation, the warhead strand (carrying the tagged protein) and the biotin strand form a complex that is held onto immobilized streptavidin. As in DNA, the PNA duplex dissociates at moderately elevated temperature; therefore, retrieval of the tagged protein is accomplished by a brief exposure to heat. Using iodoacetate as the warhead, 8-base PNA strands, biotin, and streptavidin-coated magnetic beads, we demonstrate retrieval of the cysteine protease papain. We were also able to use our iodoacetyl-PNA:PNA-biotin probe for retrieval and identification of a thiol reductase and a glutathione transferase from soybean seedling cotyledons.