腸上皮細胞の蛍光標識は、地下症の独立した長寿命の腸幹細胞を明らかにします

背景と目的：腸幹細胞のダイナミクスは、腸の機能と維持の調節に不可欠です。腸内では、遺伝的マーキング法によって腸内で皮膚幹細胞が同定されていますが、複数の陰窩幹細胞の同定は、同じ色で視覚化されているため、まだ達成されていません。 方法：腸オルガノイドをマトリゲル®に移し、レンティウイルスをエンコードするマクリーリーと混合しました。MCHERRY陽性細胞のダイナミクスは、タイムラプスイメージングを使用して分析され、MCHERRY陽性細胞の局在化を3D免疫蛍光化を使用して分析しました。 結果：マウス小腸から生成されたオルガノイドへの導入遺伝子を導入するための元の方法を確立し、それを有機体細胞の一部にマケリータンパク質の連続蛍光をもたらしました。共焦点顕微鏡を使用した3次元分析では、1年以上培養されていたオルガノイドの陰窩に単一のMCHERRY陽性細胞が示され、同じ地下室に長寿命のMCHERRY陽性幹細胞と陰性幹細胞が存在することが示唆されました。さらに、地下室の単一のMCHERRY陽性幹細胞は、陰窩ベースの柱状セルと輸送細胞の両方を生じさせました。各MCHERRY陽性および陰性細胞は、オルガノイドの生成に寄与しました。 結論：個々のオルガノイド陰窩幹細胞をマークするために元のレンチウイルス導入遺伝子系を使用すると、長寿命の複数の陰窩幹細胞が腸上皮細胞として独立して機能し、完全に機能的な絨毛が形成されることが示されました。

BACKGROUND AND AIMS: The dynamics of intestinal stem cells are crucial for regulation of intestinal function and maintenance. Although crypt stem cells have been identified in the intestine by genetic marking methods, identification of plural crypt stem cells has not yet been achieved as they are visualised in the same colour. METHODS: Intestinal organoids were transferred into Matrigel® mixed with lentivirus encoding mCherry. The dynamics of mCherry-positive cells was analysed using time-lapse imaging, and the localisation of mCherry-positive cells was analysed using 3D immunofluorescence. RESULTS: We established an original method for the introduction of a transgene into an organoid generated from mouse small intestine that resulted in continuous fluorescence of the mCherry protein in a portion of organoid cells. Three-dimensional analysis using confocal microscopy showed a single mCherry-positive cell in an organoid crypt that had been cultured for >1year, which suggested the presence of long-lived mCherry-positive and -negative stem cells in the same crypt. Moreover, a single mCherry-positive stem cell in a crypt gave rise to both crypt base columnar cells and transit amplifying cells. Each mCherry-positive and -negative cell contributed to the generation of organoids. CONCLUSIONS: The use of our original lentiviral transgene system to mark individual organoid crypt stem cells showed that long-lived plural crypt stem cells might independently serve as intestinal epithelial cells, resulting in the formation of a completely functional villus.