生物抽出物中のホスホメタボロームおよび有機酸の定量的プロファイリングのための毛細血管アニオン交換イオンクロマトグラフィータンデム質量分析

代謝プロファイリングは生物学的研究の重要なツールとなっており、質量分析検出と組み合わされた代謝物のクロマトグラフィー分離は、そのような研究で最も頻繁に使用されるアプローチです。アニオン性代謝物プールを包括的にカバーするための堅牢なクロマトグラフィー方法の確立は特に困難です。この研究では、毛細血管イオン交換クロマトグラフィー（CAPIC） - リンメタボロームの定量的プロファイリングのためのネガティブESIタンデム質量分析（MS/MS）ワークフローの開発（例：糖リン酸塩やヌクレオチド）が提示されています。クロマトグラフィー分離とMS/MS条件が最適化され、真濃度に対するエラー率の繰り返し注入と精度の精度が評価されました。この精度は、50-FMOL標準注入で平均CV％8.5％、高濃度（500-7,500 FMOL）で2.4-4.4％の範囲である毛細血管の流れシステムに優れています。検出限界（LOD）は1〜100 nm（列に5〜500 fmolが注入されます）の範囲で、定量（LOQ）の範囲は1〜500 nm（列に5-2,500 FMOLが注入されます）の範囲です。キャリーオーバーを排除し、カラムの最適な再均衡を確保するには、分析サンプル間の水中の50％メタノールの注入による高速勾配法が必要です。最後に、システムの定量的適用性は、一定容積標準添加方法（SAM）を使用して、実際の生物学的マトリックスでテストされました。ヒト腎臓HEK293細胞株の抽出物に、サンプル内の各代謝物の濃度を決定するために、標準の濃度が増加してスパイクされました。44個の代謝産物が4.1％の平均不確実性で検出されました。したがって、CAPIC-MS/MSメソッドは、ホスホメタボロームの定量的プロファイリングの優れた選択性、感度、精度を示します。

Metabolic profiling has become an important tool in biological research, and the chromatographic separation of metabolites coupled with mass spectrometric detection is the most frequently used approach for such studies. The establishment of robust chromatographic methods for comprehensive coverage of the anionic metabolite pool is especially challenging. In this study, the development of a capillary ion exchange chromatography (capIC) - negative ESI tandem mass spectrometry (MS/MS) workflow for the quantitative profiling of the phosphometabolome (e.g., sugar phosphates and nucleotides) is presented. The chromatographic separation and MS/MS conditions were optimized, and the precision of repetitive injections and accuracy in terms of error percentage to true concentration were assessed. The precision is excellent for a capillary flow system with an average CV% of 8.5% for a 50-fmol standard injection and in the lower 2.4-4.4% range for higher concentrations (500-7,500 fmol). The limit of detection (LOD) ranges from 1 to 100 nM (5-500 fmol injected on column), and the limit of quantitation (LOQ) ranges from 1 to 500 nM (5-2,500 fmol injected on column). A fast gradient method with the injection of 50% methanol in water between analytical samples is needed to eliminate carry-over and ensure optimal re-equilibration of the column. Finally, the quantitative applicability of the system was tested on real biological matrices using the constant-volume standard addition method (SAM). Extracts of the human kidney Hek293 cell line were spiked with increasing concentrations of standards to determine the concentration of each metabolite in the sample. Forty-four metabolites were detected with an average uncertainty of 4.1%. Thus, the capIC-MS/MS method exhibits excellent selectivity, sensitivity and precision for the quantitative profiling of the phosphometabolome.