質量分析による抗体DNAコンストラクト再配列シーケンスバリアントの迅速な同定

IgG1抗体候補（MAB1）の細胞株の発達中に、CHO-K1細胞株で発現する2つの産物候補クローンでC末端伸長が特定されました。拡張は、カチオン交換クロマトグラフィー（CEX-HPLC）および毛細血管電気泳動の減少（RCE-SDS）による分析後、これらのクローンに異常な新しいピークの存在として最初に観察されました。これらのCHO-K1クローンの質量分析の減少により、予想よりも大きな質量が重い鎖種の亜集団に存在することが明らかになりました。これは、既知の化学的または翻訳後修飾では説明できませんでした。重鎖のこの追加の質量は、追加のアミノ酸配列の存在によるものであると疑われました。疑わしい追加のシーケンスを特定するために、ヘビーチェーンと軽鎖の翻訳されたDNAベクターに対してプロテオーム検索と組み合わせたde novoシーケンスを実行しました。伸長を含むクローンに固有のペプチドは、軽鎖ベクトルコンストラクトの2つの非コーディングセクションからの短いシーケンス（それぞれ9および35アミノ酸に対応）を一致させる（それぞれ9および35アミノ酸に対応）同定されました。調査後、この拡張は、重鎖のc末端に対する軽鎖ベクターの非翻訳配列に由来するアミノ酸の添加により、DNA構築物の再配置によるものであることが観察されました。この観察結果は、データベース検索と組み合わせたde novoシーケンスを使用して予期しない抗体シーケンスバリアントを識別するためのプロテオーム質量分析技術の能力を示し、陽イオン交換およびRCE-SDSアッセイの新しいピークの根本原因の迅速な識別を可能にしました。

During cell line development for an IgG1 antibody candidate (mAb1), a C-terminal extension was identified in 2 product candidate clones expressed in CHO-K1 cell line. The extension was initially observed as the presence of anomalous new peaks in these clones after analysis by cation exchange chromatography (CEX-HPLC) and reduced capillary electrophoresis (rCE-SDS). Reduced mass analysis of these CHO-K1 clones revealed that a larger than expected mass was present on a sub-population of the heavy chain species, which could not be explained by any known chemical or post-translational modifications. It was suspected that this additional mass on the heavy chain was due to the presence of an additional amino acid sequence. To identify the suspected additional sequence, de novo sequencing in combination with proteomic searching was performed against translated DNA vectors for the heavy chain and light chain. Peptides unique to the clones containing the extension were identified matching short sequences (corresponding to 9 and 35 amino acids, respectively) from 2 non-coding sections of the light chain vector construct. After investigation, this extension was observed to be due to the re-arrangement of the DNA construct, with the addition of amino acids derived from the light chain vector non-translated sequence to the C-terminus of the heavy chain. This observation showed the power of proteomic mass spectrometric techniques to identify an unexpected antibody sequence variant using de novo sequencing combined with database searching, and allowed for rapid identification of the root cause for new peaks in the cation exchange and rCE-SDS assays.