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背景：新規マウスミトコンドリア関連のニュートラルスフィンゴミエリナーゼ（MA-NSMase）が最近クローン化され、部分的に特徴付けられています。酵素の細胞内局在は、ミトコンドリアで支配的であることがわかりました。この研究では、ミトコンドリア局在の決定要因とそのトポロジーが調査されました。 方法：切り捨てられたMA-NSMase領域を伴うGFPの連続領域と融合タンパク質を欠くMA-NSMase変異体を構築し、MCF-7細胞で発現しました。その局在化は、共焦点顕微鏡および細胞内分画法を使用して分析されました。MA-NSMaseのミトコンドリア局在は、分離ミトコンドリア上のプロテアーゼ保護アッセイを使用して決定されました。 結果：結果は、最初に、ゼブラフィッシュのミトコンドリアスマーゼのMLSと相同性の推定ミトコンドリア局在信号（MLS）が、マウスMA-NSMaseのミトコンドリア局在に必要ではないことを示しました。ミトコンドリア局在に十分なMa-nsmase内の2つの領域の存在、ミトコンドリア局在化の原因となるシグナル配列（アミノ酸24-56）の存在と、タンパク質をマイトコンドリア膜に固定する追加の「シグナルアンカー」シーケンス（アミノ酸77-99）の存在に関する証拠が提供されます。このタンパク質は、cとn末端の両方がサイトゾルにさらされたままである外側のミトコンドリア膜にトポロジカルに位置しています。 結論：Ma-nsmaseは、MLSを備えた膜固定タンパク質であり、そのN末端にシグナルアンカーシーケンスを備えて、ミトコンドリアの外側膜に局在します。 一般的な重要性：ミトコンドリアのスフィンゴ脂質は、細胞の生存率に重要な役割を果たすことが報告されています。この研究では、細胞機能を調査し、新しい治療標的を定義するための新しいウィンドウを開きます。
背景：新規マウスミトコンドリア関連のニュートラルスフィンゴミエリナーゼ（MA-NSMase）が最近クローン化され、部分的に特徴付けられています。酵素の細胞内局在は、ミトコンドリアで支配的であることがわかりました。この研究では、ミトコンドリア局在の決定要因とそのトポロジーが調査されました。 方法：切り捨てられたMA-NSMase領域を伴うGFPの連続領域と融合タンパク質を欠くMA-NSMase変異体を構築し、MCF-7細胞で発現しました。その局在化は、共焦点顕微鏡および細胞内分画法を使用して分析されました。MA-NSMaseのミトコンドリア局在は、分離ミトコンドリア上のプロテアーゼ保護アッセイを使用して決定されました。 結果：結果は、最初に、ゼブラフィッシュのミトコンドリアスマーゼのMLSと相同性の推定ミトコンドリア局在信号（MLS）が、マウスMA-NSMaseのミトコンドリア局在に必要ではないことを示しました。ミトコンドリア局在に十分なMa-nsmase内の2つの領域の存在、ミトコンドリア局在化の原因となるシグナル配列（アミノ酸24-56）の存在と、タンパク質をマイトコンドリア膜に固定する追加の「シグナルアンカー」シーケンス（アミノ酸77-99）の存在に関する証拠が提供されます。このタンパク質は、cとn末端の両方がサイトゾルにさらされたままである外側のミトコンドリア膜にトポロジカルに位置しています。 結論：Ma-nsmaseは、MLSを備えた膜固定タンパク質であり、そのN末端にシグナルアンカーシーケンスを備えて、ミトコンドリアの外側膜に局在します。 一般的な重要性：ミトコンドリアのスフィンゴ脂質は、細胞の生存率に重要な役割を果たすことが報告されています。この研究では、細胞機能を調査し、新しい治療標的を定義するための新しいウィンドウを開きます。
BACKGROUND: A novel murine mitochondria-associated neutral sphingomyelinase (MA-nSMase) has been recently cloned and partially characterized. The subcellular localization of the enzyme was found to be predominant in mitochondria. In this work, the determinants of mitochondrial localization and its topology were investigated. METHODS: MA-nSMase mutants lacking consecutive regions and fusion proteins of GFP with truncated MA-nSMase regions were constructed and expressed in MCF-7 cells. Its localization was analyzed using confocal microscopy and sub-cellular fractionation methods. The sub-mitochondrial localization of MA-nSMase was determined using protease protection assay on isolated mitochondria. RESULTS: The results initially showed that a putative mitochondrial localization signal (MLS), homologous to an MLS in the zebra-fish mitochondrial SMase is not necessary for the mitochondrial localization of the murine MA-nSMase. Evidence is provided to the presence of two regions in MA-nSMase that are sufficient for mitochondrial localization: a signal sequence (amino acids 24-56) that is responsible for the mitochondrial localization and an additional 'signal-anchor' sequence (amino acids 77-99) that anchors the protein to the mitochondrial membrane. This protein is topologically located in the outer mitochondrial membrane where both the C and N-termini remain exposed to the cytosol. CONCLUSIONS: MA-nSMase is a membrane anchored protein with a MLS and a signal-anchor sequence at its N-terminal to localize it to the outer mitochondrial membrane. GENERAL SIGNIFICANCE: Mitochondrial sphingolipids have been reported to play a critical role in cellular viability. This study opens a new window to investigate their cellular functions, and to define novel therapeutic targets.
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