ポリメラーゼ連鎖反応希釈シリーズから増幅効率を推定するための固定点アルゴリズム

背景：ポリメラーゼ連鎖反応は、少量のDNAを増幅して定量化します。これは、テンプレートDNAの各鎖が1つに近づく確率でコピーされる各サイクルの間に環状プロセスです。DNAの量は約2倍になり、この量は各サイクルを蛍光測定で推定でき、以下の増幅曲線と呼ばれる蛍光値のセットを生成できます。一般的に、関連性の生物学的問題は、2つのサンプルにおけるDNA濃度の比の1つです。通常、2つの増幅曲線を比較することによって推定される比率です。通常、サイクル数に対する蛍光のプロットによって。この分析の中心は、一方の増幅曲線が他の増幅曲線と比較してシフトする程度、各曲線のしきい値または定量化サイクルC qを定義することによってしばしば達成される測定値を測定することです。参照曲線に対して位置が測定される代替案を提案します。位置は、参照と観測された蛍光配列との相関を最大化するサイクルシフトに相当します。参照曲線の重要なパラメーターは、固定点収束によって取得されます。 結果：QPCR増幅効率の推定のために構築された希釈シリーズの分析を検討します。増幅効率の推定は、希釈の対数に対してc qがプロットされた場合の回帰線の勾配に基づいています。C Qを決定するために、一般的に使用される3つの方法とアプローチを比較します。それぞれが、公開可能なキャリブレーションデータセットに適用され、私たち自身の研究室から10に適用されます。確立された文献のように、私たちは彼らの相対的なメリットを、キャリブレーション曲線の勾配の標準偏差と複製蛍光曲線のc qの分散の両方から判断します。 結論：このアプローチは、実験プロトコルの変更を必要とせず、既存のデータに遡及的に適用できます。ラボがリアルタイムPCRデータを解釈する方法論的ツールキットに追加することをお勧めします。

BACKGROUND: The polymerase chain reaction amplifies and quantifies small amounts of DNA. It is a cyclic process, during each cycle of which each strand of template DNA is copied with probability approaching one: the amount of DNA approximately doubles and this amount can be estimated fluorimetrically each cycle, producing a set of fluorescence values hereafter referred to as the amplification curve. Commonly the biological question of relevance is one of the ratio of DNA concentrations in two samples: a ratio that is deduced by comparing the two amplification curves, usually by way of a plot of fluorescence against cycle number. Central to this analysis is measuring the extent to which one amplification curve is shifted relative to the other, a measurement often accomplished by defining a threshold or quantification cycle, C q , for each curve: the fractional cycle number at which fluorescence reaches some threshold or at which some other criterion (maximum slope, maximum rate of change of slope) is satisfied. We propose an alternative where position is measured relative to a reference curve; position equates to the cycle shift which maximizes the correlation between the reference and the observed fluorescence sequence. A key parameter of the reference curve is obtained by fixed-point convergence. RESULTS: We consider the analysis of dilution series constructed for the estimation of qPCR amplification efficiency. The estimate of amplification efficiency is based on the slope of the regression line when the C q is plotted against the logarithm of dilution. We compare the approach to three commonly used methods for determining C q ; each is applied to publicly accessible calibration data sets, and to ten from our own laboratory. As in the established literature we judge their relative merits both from the standard deviation of the slope of the calibration curve, and from the variance in C q for replicate fluorescence curves. CONCLUSIONS: The approach does not require modification of experimental protocols, and can be applied retrospectively to existing data. We recommend that it be added to the methodological toolkit with which laboratories interpret their real-time PCR data.