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単一細胞の単一コピー感度における主要なmRNAの量と局在に関する細胞固有の情報は、療法の基本的な細胞プロセス、疾患リスク、および有効性を評価するために重要です。回折制限を超えた過剰発現mRNAの定量化は、プローブと顕微鏡技術の光学特性によって制約されます。このレポートでは、ナノサイズのバリウム酸化チタン（BATIO3、BTO）結晶は、2番目の高調波超解像度顕微鏡（SHASM）によってmRNA定量化のプローブとして利用されました。SHASMは、55.6 nmの分解能で、回折制限スポットで複数のmRNAコピーを解決する能力を備えた、55.6 nmの解像度でヒトの表皮成長因子受容体2（HER2）mRNAの単一のコピーを検出することができました。細胞あたりのHER2 mRNAは、SK-BR-3、MCF-7、およびHELA細胞株でそれぞれ595±79.1、38.9±8.26、および1.5±2.8でカウントされました。単一細胞の定量化結果は、蛍光in situハイブリダイゼーション研究と定量的PCRで検証され、転写産物検出のための現在の単一分子アプローチに対する特異性と選択性が向上しました。SHASMは、ビデオレートで細胞内転写ダイナミクスを監視する能力を備えた単一の細胞内の〜10（4）転写産物を解決する上限があると予想されます。開発されたアプローチは、臨床研究や癌などの生命を脅かす疾患の早期診断において強い可能性を秘めています。
単一細胞の単一コピー感度における主要なmRNAの量と局在に関する細胞固有の情報は、療法の基本的な細胞プロセス、疾患リスク、および有効性を評価するために重要です。回折制限を超えた過剰発現mRNAの定量化は、プローブと顕微鏡技術の光学特性によって制約されます。このレポートでは、ナノサイズのバリウム酸化チタン（BATIO3、BTO）結晶は、2番目の高調波超解像度顕微鏡（SHASM）によってmRNA定量化のプローブとして利用されました。SHASMは、55.6 nmの分解能で、回折制限スポットで複数のmRNAコピーを解決する能力を備えた、55.6 nmの解像度でヒトの表皮成長因子受容体2（HER2）mRNAの単一のコピーを検出することができました。細胞あたりのHER2 mRNAは、SK-BR-3、MCF-7、およびHELA細胞株でそれぞれ595±79.1、38.9±8.26、および1.5±2.8でカウントされました。単一細胞の定量化結果は、蛍光in situハイブリダイゼーション研究と定量的PCRで検証され、転写産物検出のための現在の単一分子アプローチに対する特異性と選択性が向上しました。SHASMは、ビデオレートで細胞内転写ダイナミクスを監視する能力を備えた単一の細胞内の〜10（4）転写産物を解決する上限があると予想されます。開発されたアプローチは、臨床研究や癌などの生命を脅かす疾患の早期診断において強い可能性を秘めています。
Cell-specific information on the quantity and localization of key mRNAs at single copy sensitivity in single cells is critical for evaluating basic cellular process, disease risk, and efficacy of therapy. Quantification of overexpressed mRNAs beyond the diffraction limit is constrained by the optical property of the probes and microscopy techniques. In this report, nanosized barium titanium oxide (BaTiO3, BTO) crystals were utilized as probes for mRNA quantification by a second harmonic super-resolution microscopy (SHaSM). The SHaSM was able to detect a single copy of the human epidermal growth factor receptor 2 (Her2) mRNA at a resolution of 55.6 nm with the ability to resolve multiple mRNA copies in a diffraction-limited spot. Her2 mRNA per cell was counted in SK-BR-3, MCF-7, and HeLa cell lines as 595±79.1, 38.9±8.26, and 1.5±2.8, respectively. Our single-cell quantification results were validated with the fluorescence in situ hybridization studies and quantitative PCR, showing better specificity and selectivity over current single-molecule approaches for transcript detection. The SHaSM is expected to have an upper limit of resolving ∼10(4) transcripts in a single cell with the ability to monitor intracellular transcriptional dynamics at video rate. The developed approach has strong potential in clinical research and in the early diagnosis of life-threatening diseases such as cancer.
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