Auナノ粒子包埋SPRバイオセンサーによる標的プライミングローリングサークル増幅によるマイコバクテリウムゲノムDNAのリアルタイムモニタリング

この研究では、2つの病原性マイコバクテリアの等温および迅速な検出のためのターゲットプライミングローリングサークル増幅（RCA）に基づく表面プラズモン共鳴（SPR）DNAバイオセンサーアレイを開発しました。。種固有の南京錠プローブ（PLP）は、16S-23S rRNA遺伝子内部転写スペーサー（ITS）。ライゲーション後、円形のPLPは、初期RCAのターゲットシーケンスによってプライミングされる可能性があります。RCAは、切断反応と同時に実行され、単一鎖DNAの小さな断片を生成し、変性せずにセンサーチップに固定されたプローブですぐにハイブリダイズしました。このプロセスにより、チップ表面のSPR角度の変化が発生したため、ソリューションからの分析の検出が達成可能であり、Mycobacteriumの動的リアルタイムRCAモニタリングが可能になりました。さらに、Auナノ粒子（AUNP）は、ラベルフリー検出システムとしての感度を高めるために、ヘキサネジオール（HDT）を介してセンサーチップの表面に直接組み立てられました。実験結果は、AUNPS包埋された表面とターゲットプライミングされたRCAによる信号の強化が、裸のSPRチップ法の従来のRCAと比較して、少なくとも10倍の感度の増加を引き起こしたことを示しています。臨床サンプルからの20amolの合成ターゲットの20amolと10（4）のゲノムDNAの40分以内に、臨床サンプルからのゲノムDNAのcfuml（-1）以内に検出できます。提案された方法は、液相増幅モニタリングの単純な設計アイデアを提供するだけでなく、臨床病原体検出にも適用します。

In this study, we developed a surface plasmon resonance (SPR) DNA biosensor array based on target-primed rolling circle amplification (RCA) for isothermal and rapid detection of two pathogenic mycobacteria, Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) and Mycobacterium avium complex (MAC).The species-specific padlock probe (PLP) was designed to target the sequence in 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer (ITS). After ligation, the circularized PLP could be primed by the target sequence to initial RCA. The RCA performed simultaneously with the cleavage reaction to produce small fragments of single strand DNA which immediately hybridized with the probe immobilized on the sensor chip without denaturation. This process caused SPR angle changes on the chip surface, which made the detection for analysis from the solution achievable, and dynamic real-time RCA monitoring of mycobacterium possible. Besides, Au nanoparticles (AuNPs) were directly assembled onto the surface of the sensor chip via hexanedithiol (HDT) for the enhancement of sensitivity as a label-free detection system. Experimental results show that the signal enhancement by the target-primed RCA together with AuNPs-embedded surface caused at least10-fold increased sensitivity as compared with conventional RCA on bare SPR chip method. Within 40min amplification duration as low as 20amol of synthetic targets and 10(4)CFUmL(-1) of genomic DNA from clinical samples can be detected. The proposed method not only provides a simple design idea for liquid-phase amplification monitoring, but also apply it in clinical pathogen detection, which holds great promise in ultrasensitive bioassay in the future.