迅速なジヌクレオチド測定および阻害剤スクリーニングのための生物発光細胞ベースのNAD（P）/NAD（P）Hアッセイ

たとえば、細胞エネルギー代謝とシグナル伝達におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの中心的な役割は、細胞の代謝状態をエネルギー恒常性および遺伝子調節と結び付ける重要なノードになります。この研究では、これらの重要な酸化還元補因子の迅速かつ敏感な測定のための細胞ベースの生物発光アッセイの実装について説明します。アッセイの感度（検出限界〜0.5 nm）により、細胞溶解物における非リン酸化またはリン酸化ジヌクレオチドの総量の選択的検出が可能になることを示します。NAD+NADHまたはNADP+NADPHレベルの総量は、それぞれ300個または600個のセル/ウェルという低い状態で検出できます。信号は、NAD+NADHでは100から200、NADP+NADPH検出の場合は50から100の範囲の最大信号対バックグラウンド比を持つ最大5,000セル/ウェルまで線形のままです。アッセイは堅牢で（Z '値> 0.7）、既知のNAD生合成経路阻害剤FK866を使用して生成された阻害剤応答曲線は、報告されたデータとよく相関しています。さらに重要なことに、蛍光非代謝細胞生存率アッセイを使用してジヌクレオチド検出アッセイを多重化することにより、細胞生存率の変化の前にFK866治療によってジヌクレオチドレベルが劇的に減少する（> 80％）が検出されることを示しています。細胞内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドレベルのモジュレーターを特定するためのアッセイの有用性は、腫瘍学活性化合物ライブラリを使用してさらに確認されました。そこでは、新しいジヌクレオチド調節化合物が特定されました。たとえば、ヒストン脱アセチルゼ阻害剤エントノスタットは、細胞ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの強力な阻害剤でしたが、選択的エストロゲン受容体モジュレーターラロキシフェンは予期せずに細胞ニコチンアミドアデニンジンクラウオチドレベルの2倍の増加を引き起こしました。

Abstract The central role of nicotinamide adenine dinucleotides in cellular energy metabolism and signaling makes them important nodes that link the metabolic state of cells with energy homeostasis and gene regulation. In this study, we describe the implementation of cell-based bioluminescence assays for rapid and sensitive measurement of those important redox cofactors. We show that the sensitivity of the assays (limit of detection ∼0.5 nM) enables the selective detection of total amounts of nonphosphorylated or phosphorylated dinucleotides directly in cell lysates. The total amount of NAD+NADH or NADP+NADPH levels can be detected in as low as 300 or 600 cells/well, respectively. The signal remains linear up to 5,000 cells/well with the maximum signal-to-background ratios ranging from 100 to 200 for NAD+NADH and from 50 to 100 for NADP+NADPH detection. The assays are robust (Z' value >0.7) and the inhibitor response curves generated using a known NAD biosynthetic pathway inhibitor FK866 correlate well with the reported data. More importantly, by multiplexing the dinucleotide detection assays with a fluorescent nonmetabolic cell viability assay, we show that dinucleotide levels can be decreased dramatically (>80%) by FK866 treatment before changes in cell viability are detected. The utility of the assays to identify modulators of intracellular nicotinamide adenine dinucleotide levels was further confirmed using an oncology active compound library, where novel dinucleotide regulating compounds were identified. For example, the histone deacetylase inhibitor entinostat was a potent inhibitor of cellular nicotinamide adenine dinucleotides, whereas the selective estrogen receptor modulator raloxifene unexpectedly caused a twofold increase in cellular nicotinamide adenine dinucleotide levels.