変異体ベータを発現する細胞におけるアゴニスト刺激cAMP蓄積のパターンの変化2-アドレナリン受容体を欠くリン酸化部位を欠く

他の多くの受容体効果システムと同様に、ベータアドレナリン受容体（Beta AR）/Adenylylシクラーゼ系の応答性は、アゴニスト曝露時に脱感作を受けます。cAMP依存性プロテインキナーゼ（プロテインキナーゼA）およびベータARキナーゼによる受容体のリン酸化は、そのような脱感作現象現象で役割を果たすように見えますが、無傷細胞における受容体リン酸化の機能的重要性は以前に評価されていません。この研究では、哺乳類の線維芽細胞系で、これら2つのプロテインキナーゼの推定リン酸化部位を欠く受容体の正常（野生型）ヒトベータ2 ARおよび変異体型を構築および発現させました。プロテインキナーゼAによるリン酸化の2つのコンセンサス配列は、セリン261、262および345、346をアラニンに変化させることにより変化しました。別の変異体では、推定ベータARキナーゼリン酸化部位を構成するタンパク質のカルボキシ末端にある11のセリンとスレオニンがアラニンまたはグリシンに変更されました。変異した受容体は、アゴニストや拮抗薬の親和性や、アデニリルシクラーゼのアゴニスト刺激を媒介する能力において、野生型と違いはありませんでした。さらに、培養細胞におけるそれらの発現レベルは同じでした。ベータARアゴニストのイソプロテレノールで刺激されると、野生型または変異体受容体のいずれかを持つ細胞は、最初の2分間、本質的に同一の速度でcAMPを生成しました。野生型受容体を持つ細胞は、刺激の最初の数分後にcAMP生産の著しく低下することを特徴とする急速な脱感作を示しました。しかし、受容体の変異型のいずれかを持つ細胞は、はるかに少ない脱感作を示し、野生型受容体を発現する細胞で観察されたものよりも3〜4倍の速度でcAMPを生成し続けました。対照的に、プロスタグランジンE1とフォルスコリンによって刺激された無傷の細胞cAMPレベルは、野生型または変異ベータARを持つ細胞間で違いはありませんでした。これらの結果は、無傷の細胞における急速なアゴニスト誘発性脱感作の調節におけるベータARのリン酸化の重要な生理学的役割を示唆しています。

As with many other receptor-effector systems, the responsiveness of the beta-adrenergic receptor (beta AR)/adenylyl cyclase system undergoes desensitization upon agonist exposure. Phosphorylations of the receptor by the cAMP-dependent protein kinase (protein kinase A) and the beta AR kinase appear to play roles in such desensitization phenomena, but the functional significance of the receptor phosphorylation in intact cells has not been previously assessed. In this study, we constructed and expressed in a mammalian fibroblast line the normal (wild type) human beta 2 AR and mutant forms of the receptor that lack the putative phosphorylation sites for these two protein kinases. The two consensus sequences for phosphorylation by protein kinase A were altered by changing serines 261, 262 and 345, 346 to alanines. In another mutant, the 11 serines and threonines at the carboxy terminus of the protein that constitute the putative beta AR kinase phosphorylation sites were changed to alanines or glycines. The mutated receptors did not differ from the wild type in their affinities for agonists or antagonists or in their ability to mediate agonist stimulation of adenylyl cyclase. Moreover, their levels of expression in the cultured cells were the same. When stimulated with the beta AR agonist isoproterenol, cells bearing either the wild type or mutant receptors generated cAMP at essentially identical rates for the first 2 min. Cells bearing wild type receptors then showed a rapid desensitization characterized by a markedly diminished rate of cAMP production after the first few minutes of stimulation. However, cells bearing either of the mutated forms of the receptor showed much less desensitization and continued to generate cAMP at a rate 3-4 times greater than that observed in cells expressing the wild type receptor. In contrast, intact cell cAMP levels stimulated by prostaglandin E1 and forskolin were not different between cells bearing wild type or mutant beta AR. These results suggest an important physiological role for phosphorylation of the beta AR in regulating rapid agonist-induced desensitization in intact cells.