BIRAを使用した精製タンパク質の部位特異的ビオチン化

ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンの間の結合は、最も強力な非共有生物学的相互作用の1つです。（連鎖球菌）アビジン - ビオチン相互作用は、生物学的研究とバイオテクノロジーで何十年も広く使用されてきました。したがって、ビオチンによる精製タンパク質の標識は、タンパク質の捕獲、固定化、および機能化、ならびに多重化または架橋分子を実現する強力な方法です。化学ビオチン化はしばしば不均一な産物を生成し、機能が機能している可能性があります。大腸菌ビオチンリガーゼ（BIRA）による酵素ビオチン化は、15アミノ酸アビタグペプチドにビオチンを共有結合することに非常に特異的であり、高収量の均一な生成物を与えます。AVITAGは、N末端、C末端、または標的タンパク質の露出ループで遺伝的に便利に追加できます。ここでは、逆PCRによるAVITAG挿入の手順、大腸菌のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST-BIRA）に融合したビラの精製、精製タンパク質のBIRAビオチン化、およびSDS-PAGEによるゲルシフト分析を説明して、範囲を定量化します。ビオチン化の。

The binding between biotin and streptavidin or avidin is one of the strongest known non-covalent biological interactions. The (strept)avidin-biotin interaction has been widely used for decades in biological research and biotechnology. Therefore labeling of purified proteins by biotin is a powerful way to achieve protein capture, immobilization, and functionalization, as well as multimerizing or bridging molecules. Chemical biotinylation often generates heterogeneous products, which may have impaired function. Enzymatic biotinylation with E. coli biotin ligase (BirA) is highly specific in covalently attaching biotin to the 15 amino acid AviTag peptide, giving a homogeneous product with high yield. AviTag can conveniently be added genetically at the N-terminus, C-terminus, or in exposed loops of a target protein. We describe here procedures for AviTag insertion by inverse PCR, purification of BirA fused to glutathione-S-transferase (GST-BirA) from E. coli, BirA biotinylation of purified protein, and gel-shift analysis by SDS-PAGE to quantify the extent of biotinylation.