ホルムアルデヒドによるRNAの変性と電気泳動

電気泳動サイズの分別は、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル上で、大きなmRNA分子（0.5〜10 kb）を分離して分離するために使用できます。ホルムアルデヒドには、グアニン、アデニン、およびシトシンのイミノまたはアミノ基とシッフ塩基を形成するために反応するカルボニル基が含まれています。これらの共有付加物は、通常のベースペアリングを防ぎ、変性状態でRNAを維持します。これらの付加物は不安定であるため、形成状態にはRNAを維持するために、ホルムアルデヒドがゲルに存在する必要があります。このプロトコルは、ホルムアルデヒドを伴うアガロースゲルの調製と、水平方向の電気泳動装置でのセットアップについて説明しています。RNAサンプルは、ホルムアミドとホルムアルデヒドの溶液で調製および変性し、0.5〜10 kbサイズのマーカーを使用して、ゲルを介して電気泳動を受けます。電気泳動に続いて、ゲルは染色され、いくつかの異なるタイプの染色の1つを使用してRNAマーカーまたはRRNAを視覚化します。

Electrophoretic size fractionation can be used to denature and separate large mRNA molecules (0.5-10 kb) on formaldehyde-containing agarose gels. Formaldehyde contains a carbonyl group that reacts to form Schiff bases with the imino or amino groups of guanine, adenine, and cytosine. These covalent adducts prevent normal base pairing and maintain the RNA in a denatured state. Because these adducts are unstable, formaldehyde must be present in the gel to maintain the RNA in the denatured state. This protocol describes the preparation of an agarose gel with formaldehyde and its setup in a horizontal electrophoresis apparatus. RNA samples are prepared and denatured in a solution of formamide and formaldehyde and, with 0.5- to 10-kb size markers, subjected to electrophoresis through the gel. Following electrophoresis, the gel is stained to visualize RNA markers or rRNA using one of several different types of stains.