in vitro再構築されたヒト組織（RHT）ベースのテスト方法でのホルマザンの検出のためのHPLC/UPLCスペクトロポトー測定の使用MTT還元アッセイを使用して、その適用性を強く着色された試験化学物質に拡大する

再構築されたヒト組織（RHT）を使用した多くのin vitro試験方法は、皮膚腐食/刺激の評価のために承認されています。このような方法では、テスト化学腐食/刺激の可能性は、測光MTT還元アッセイを使用して組織の生存率を測定することにより決定されます。このアッセイの既知の制限は、吸光度（OD）によるホルマザンの測定による強力な色の試験化学物質の干渉です。これに対処するために、化粧品ヨーロッパは、代替のホルマザン測定システムとしてのHPLC/UPLCスペクトロポート測定の使用を評価しました。生体分析法の検証のためにFDAガイダンスが推奨するアプローチを使用して、3つの独立した研究所が、HPLC/UPLCスペクト化測定システムを確立し、組織抽出物から再現性に測定するためにホルマザンを再現できるように測定しました。次に、眼/皮膚の刺激と皮膚腐食についてRHTテストシステムで最大26個の化学物質をテストしました。結果は次のことをサポートしています。（1）HPLC/UPLCスペクトロポートメトリーフォーマザン測定は非常に再現性があります。（2）HPLC/UPLC分析中の栄養測定法によるホルマザン測定とODは、色干渉や直接MTT削減を示さない試験化学物質に対してほぼ同一の組織のバイアビリティを与えました。（3）使用された試験システムとは無関係に、HPLC/UPLCスペクトロカモ測定は、吸光度のみで不可能な場合、強力な色の試験化学物質のホルマザンを測定できます。したがって、使用された試験システムや、これらのテスト方法の適用性を強く着色された化学物質に拡張するために評価された毒性エンドポイントに関係なく、ホルマザンを測定するHPLC/UPLC分析法をin vitro RHTベースのテスト方法の手順に含めることをお勧めします。。

A number of in vitro test methods using Reconstructed human Tissues (RhT) are regulatory accepted for evaluation of skin corrosion/irritation. In such methods, test chemical corrosion/irritation potential is determined by measuring tissue viability using the photometric MTT-reduction assay. A known limitation of this assay is possible interference of strongly coloured test chemicals with measurement of formazan by absorbance (OD). To address this, Cosmetics Europe evaluated use of HPLC/UPLC-spectrophotometry as an alternative formazan measurement system. Using the approach recommended by the FDA guidance for validation of bio-analytical methods, three independent laboratories established and qualified their HPLC/UPLC-spectrophotometry systems to reproducibly measure formazan from tissue extracts. Up to 26 chemicals were then tested in RhT test systems for eye/skin irritation and skin corrosion. Results support that: (1) HPLC/UPLC-spectrophotometry formazan measurement is highly reproducible; (2) formazan measurement by HPLC/UPLC-spectrophotometry and OD gave almost identical tissue viabilities for test chemicals not exhibiting colour interference nor direct MTT reduction; (3) independent of the test system used, HPLC/UPLC-spectrophotometry can measure formazan for strongly coloured test chemicals when this is not possible by absorbance only. It is therefore recommended that HPLC/UPLC-spectrophotometry to measure formazan be included in the procedures of in vitro RhT-based test methods, irrespective of the test system used and the toxicity endpoint evaluated to extend the applicability of these test methods to strongly coloured chemicals.