組換えアデノ関連ウイルス（RAAV）ベクトルは、培養された新生児および成体ミクログリアの効率的な遺伝子形質導入を媒介します

ミクログリアは、CNSの自然免疫応答を媒介する骨髄細胞の特殊な集団です。ミクログリアの挙動を調節する細胞および分子のメカニズムを特定する努力は、遺伝子発現を操作するための効果的なツールがないことによって妨げられてきました。培養ミクログリアは、ほとんどの化学および電気トランスフェクションの方法に耐抵抗性があり、遺伝子送達がほとんどまたはまったく生成されず、毒性および/または炎症性の活性化を引き起こします。組換えアデノ関連ウイルス（RAAV）ベクトルは、多くの原発性細胞タイプと組織を伝導するために一般的に使用される非エンベロープの一本鎖DNAベクターです。この研究では、培養ミクログリアの遺伝子発現を調節するために、RAAV血清型2（RAAV2）を利用することの実現可能性と効率を評価しました。Raav2は高い形質導入をもたらし、新生児および成体の両方のミクログリアの両方で最小限の毒性または炎症反応を引き起こします。Raavの形質導入が機能性タンパク質発現を誘導できることを実証するために、CREリコンビナーゼを発現するRAAV2を使用して、培養ミクログリアのLOXPフランクされたmiR155遺伝子を正常に切除しました。さらにRAAV血清型5、6、8、および9を評価し、すべての効率的に導入された培養ミクログリアをさまざまな成功し、炎症性遺伝子発現の変化をほとんどまたはまったく引き起こさないことを観察しました。これらの結果は、機械的および治療的な目的のために、ミクログリアにおけるRAAVを介した遺伝子発現の適用に強い励ましを提供します。新生児ミクログリアは機能的に成人ミクログリアとは異なりますが、in vitro研究の大部分は、成体細胞の培養が難しいためにげっ歯類の新生児ミクログリア培養を利用しています。さらに、培養されたミクログリアは、遺伝子発現を修正するためのほとんどの方法に抵抗性です。ここでは、成体ミクログリアを培養するための新しいプロトコルを開発し、組換えアデノ関連ウイルス（RAAV）を利用して培養ミクログリアの遺伝子発現を調節することの実現可能性と効率を評価しました。

Microglia are a specialized population of myeloid cells that mediate CNS innate immune responses. Efforts to identify the cellular and molecular mechanisms that regulate microglia behaviors have been hampered by the lack of effective tools for manipulating gene expression. Cultured microglia are refractory to most chemical and electrical transfection methods, yielding little or no gene delivery and causing toxicity and/or inflammatory activation. Recombinant adeno-associated viral (rAAVs) vectors are non-enveloped, single-stranded DNA vectors commonly used to transduce many primary cell types and tissues. In this study, we evaluated the feasibility and efficiency of utilizing rAAV serotype 2 (rAAV2) to modulate gene expression in cultured microglia. rAAV2 yields high transduction and causes minimal toxicity or inflammatory response in both neonatal and adult microglia. To demonstrate that rAAV transduction can induce functional protein expression, we used rAAV2 expressing Cre recombinase to successfully excise a LoxP-flanked miR155 gene in cultured microglia. We further evaluated rAAV serotypes 5, 6, 8, and 9, and observed that all efficiently transduced cultured microglia to varying degrees of success and caused little or no alteration in inflammatory gene expression. These results provide strong encouragement for the application of rAAV-mediated gene expression in microglia for mechanistic and therapeutic purposes. Neonatal microglia are functionally distinct from adult microglia, although the majority of in vitro studies utilize rodent neonatal microglia cultures because of difficulties of culturing adult cells. In addition, cultured microglia are refractory to most methods for modifying gene expression. Here, we developed a novel protocol for culturing adult microglia and evaluated the feasibility and efficiency of utilizing Recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) to modulate gene expression in cultured microglia.