成体幹細胞および線維芽細胞におけるウイルスおよびDNA独立タンパク質発現を強化するために、修飾mRNAの最適化された特性を定義する

背景：細胞の再プログラミングと遺伝子治療のためのほとんどの戦略は、ウイルス送達後のDNAの導入に基づいています。これらの目標に伴う高いリスクを回避するには、さまざまな細胞タイプの非ウイルスおよびDNAのない送達方法が必要です。 方法：便利なテンプレートDNA産生のために最初に確立されたPCRベースのプロトコルに依存して、5つの異なる改変EGFP mRNA（MMRNA）種を合成し、5メチルシチジン-5'-トリリン酸（5mc）およびシュドゥルジン-5'-トリプホン酸（ψ）を組み込みました。次に、i）タンパク質発現効率とii）異なる起源のヒト間葉系幹細胞（HMSC）および線維芽細胞の細胞生存率に対するそれらの影響を調査しました。 結果：我々のプロトコルは、in vitroで非常に効率的なMMRNA産生を可能にし、細胞トランスフェクション後の迅速で安定したタンパク質発現を可能にします。ただし、我々の結果は、特定の細胞タイプごとのパイロット実験で、終末期の最適な変更を定義する必要があることも示しています。MMRNA MyodをコードするMMRNAを使用して、線維芽細胞を骨格筋芽細胞に変換するためのアプローチを移し、ウイルスおよびDNA-Free再プログラミング戦略に対するMMRNAベースのタンパク質発現の大きな可能性を確認します。 結論：達成された高タンパク質発現レベルは、線維芽細胞だけでなくHMSCでも良好な細胞生存率と組み合わされ、ゆっくりと増殖する成体幹細胞を含むさまざまな細胞タイプのMMRNAベースの修飾に有望なオプションを提供します。したがって、私たちの発見は、効率的な細胞再プログラミングと遺伝子治療アプローチの改善に大きく貢献すると確信しています。

BACKGROUND: By far, most strategies for cell reprogramming and gene therapy are based on the introduction of DNA after viral delivery. To avoid the high risks accompanying these goals, non-viral and DNA-free delivery methods for various cell types are required. METHODS: Relying on an initially established PCR-based protocol for convenient template DNA production, we synthesized five differently modified EGFP mRNA (mmRNA) species, incorporating various degrees of 5-methylcytidine-5'-triphosphate (5mC) and pseudouridine-5'-triphosphate (Ψ). We then investigated their effect on i) protein expression efficiencies and ii) cell viability for human mesenchymal stem cells (hMSCs) and fibroblasts from different origins. RESULTS: Our protocol allows highly efficient mmRNA production in vitro, enabling rapid and stable protein expression after cell transfection. However, our results also demonstrate that the terminally optimal modification needs to be defined in pilot experiments for each particular cell type. Transferring our approach to the conversion of fibroblasts into skeletal myoblasts using mmRNA encoding MyoD, we confirm the huge potential of mmRNA based protein expression for virus- and DNA-free reprogramming strategies. CONCLUSION: The achieved high protein expression levels combined with good cell viability not only in fibroblasts but also in hMSCs provides a promising option for mmRNA based modification of various cell types including slowly proliferating adult stem cells. Therefore, we are confident that our findings will substantially contribute to the improvement of efficient cell reprogramming and gene therapy approaches.