Dumbbell-PCR：末端配列で単一のヌクレオチド分解能を持つ特定の小さなRNAバリアントを定量化する方法

次世代シーケンス技術の最近の進歩により、細胞機能RNAは常に固定末端配列を持つ単一エンティティとして表されるわけではなく、長さと末端シーケンスの両方で複雑な不均一性を持つ複数のアイソフォームとして、マイクロRNAのアイソフォームなどの複雑なアイソフォームとして表現されています。異種RNA発現の生合成と生物学的意義を解明するには、各RNAバリアントの特徴的な分析が必要です。ここでは、特定の個々の小さなRNAバリアントを明確に定量化する効率的で便利な方法であるDumbbell PCR（DB-PCR）の開発を報告します。DB-PCRでは、5'-および3'-STEMループアダプターは、T4 RNAリガーゼ2（RNL2）によって、それぞれ5'および3'末端のターゲットRNAと3'エンドと3'エンドに特異的にハイブリダイズされ、結紮されます。その後、「ダンベルのような」構造を備えた結果として得られるライゲーション産物は、TaqMan RT-PCRによって定量化されます。ターゲットRNAに対するRNL2ライゲーションとTaqMan RT-PCRの高い特異性が、DB-PCRが対応する末端RNAを特異的に検出したが、標的RNAを特異的に検出したように、単一ヌクレオチド分解能を持つターゲットRNAの5'および3'末端配列の両方を保証したことを確認しました。DB-PCRは、さまざまな細胞タイプにおけるさまざまな小さなRNAの定量化に幅広い適用可能性があり、結果は他の定量化法の結果と一致していました。したがって、DB-PCRは、RNA末端の不均一性を分析するための非常に必要な簡単な方法を提供します。

Recent advances in next-generation sequencing technologies have revealed that cellular functional RNAs are not always expressed as single entities with fixed terminal sequences but as multiple isoforms bearing complex heterogeneity in both length and terminal sequences, such as isomiRs, the isoforms of microRNAs. Unraveling the biogenesis and biological significance of heterogenetic RNA expression requires distinctive analysis of each RNA variant. Here, we report the development of dumbbell PCR (Db-PCR), an efficient and convenient method to distinctively quantify a specific individual small RNA variant. In Db-PCR, 5'- and 3'-stem-loop adapters are specifically hybridized and ligated to the 5'- and 3'-ends of target RNAs, respectively, by T4 RNA ligase 2 (Rnl2). The resultant ligation products with 'dumbbell-like' structures are subsequently quantified by TaqMan RT-PCR. We confirmed that high specificity of Rnl2 ligation and TaqMan RT-PCR toward target RNAs assured both 5'- and 3'-terminal sequences of target RNAs with single nucleotide resolution so that Db-PCR specifically detected target RNAs but not their corresponding terminal variants. Db-PCR had broad applicability for the quantification of various small RNAs in different cell types, and the results were consistent with those from other quantification method. Therefore, Db-PCR provides a much-needed simple method for analyzing RNA terminal heterogeneity.