RNA干渉酵素の連続蛍光アッセイにおけるdicer-argonaute2複合体

RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）におけるRNA処理の機械的研究は、酵素活性の継続的な監視のための方法の欠如によって妨げられてきました。RNAi酵素の「クエンチャーレス」蛍光基質は、詳細な速度論研究のために酵素反応を継続的に監視できるようにします。組換えRISC酵素は、ヒトチミジル酸シンターゼ（TYMS）および低酸素誘導因子1-αサブユニット（HIF1A）を標的とする蛍光基質を切断します。蛍光性dsRNA Dicer基質と蛍光siRNAを使用して、Dicer+Argonaute2混合物は、いずれかの酵素単独とTRBPの添加を比較して相乗的な酵素活性を示しません。酵素アッセイ中のago2およびダイサーの滴定は、Aga2とDicerが等極比で機能的な高親和性複合体を形成することを示唆しています。Dicer and Dicer+Ago2は、Dicer基質を使用してMichaelis-Menten速度論を示しています。ただし、Ago2はダイカル酵素なしで蛍光剤siRNAを処理することはできず、Aga2はsiRNAをその活性部位に自己負荷できないことを示唆しています。Dicer+Ago2の組み合わせは、基質阻害速度（Ki = 105 nm）を備えた蛍光因子性siRNA基質（km = 74 nm）を処理し、siRNAがRISCでのダイシングと2回の荷重反応に影響を与える2つの異なる部位に結合することを実験的に示します。この結果は、Dicerの活性部位に結合したsiRNA（Dicerの産物）が、Dicer+Ago2複合体のAgo2の活性部位に直接転送される可能性があることを示唆しています。競合的基質アッセイは、蛍光siRNAのDICER+AGO2の切断が特異的であることを示しています。これは、蛍光速度の濃度依存性の減少を引き起こす競合する基質として機能するため、蛍光基質として機能するためです。in vitroでの一連のダイサー基質の競合基板アッセイは、HIF1A mRNAノックダウンの細胞ベースのアッセイと相関しており（log-logスロープ= 0.29）、Dicer+Ago2複合体による10倍の処理によるダイサー基質設計の改善を示唆しています。mRNAノックダウンの効力の強力な（〜2800倍）改善を提供します。この研究では、核酸ベースの治療法を最適化するための系統的な生化学的アプローチの基礎となります。

Mechanistic studies of RNA processing in the RNA-Induced Silencing Complex (RISC) have been hindered by lack of methods for continuous monitoring of enzymatic activity. "Quencherless" fluorogenic substrates of RNAi enzymes enable continuous monitoring of enzymatic reactions for detailed kinetics studies. Recombinant RISC enzymes cleave the fluorogenic substrates targeting human thymidylate synthase (TYMS) and hypoxia-inducible factor 1-α subunit (HIF1A). Using fluorogenic dsRNA DICER substrates and fluorogenic siRNA, DICER+ARGONAUTE2 mixtures exhibit synergistic enzymatic activity relative to either enzyme alone, and addition of TRBP does not enhance the apparent activity. Titration of AGO2 and DICER in enzyme assays suggests that AGO2 and DICER form a functional high-affinity complex in equimolar ratio. DICER and DICER+AGO2 exhibit Michaelis-Menten kinetics with DICER substrates. However, AGO2 cannot process the fluorogenic siRNA without DICER enzyme, suggesting that AGO2 cannot self-load siRNA into its active site. The DICER+AGO2 combination processes the fluorogenic siRNA substrate (Km=74 nM) with substrate inhibition kinetics (Ki=105 nM), demonstrating experimentally that siRNA binds two different sites that affect Dicing and AGO2-loading reactions in RISC. This result suggests that siRNA (product of DICER) bound in the active site of DICER may undergo direct transfer (as AGO2 substrate) to the active site of AGO2 in the DICER+AGO2 complex. Competitive substrate assays indicate that DICER+AGO2 cleavage of fluorogenic siRNA is specific, since unlabeled siRNA and DICER substrates serve as competing substrates that cause a concentration-dependent decrease in fluorescent rates. Competitive substrate assays of a series of DICER substrates in vitro were correlated with cell-based assays of HIF1A mRNA knockdown (log-log slope=0.29), suggesting that improved DICER substrate designs with 10-fold greater processing by the DICER+AGO2 complex can provide a strong (~2800-fold) improvement in potency for mRNA knockdown. This study lays the foundation of a systematic biochemical approach to optimize nucleic acid-based therapeutics for Dicing and ARGONAUTE2-loading for improving efficacy.