RAB7 GTPaseとRAB相互作用リソソームタンパク質（RILP）エフェクタータンパク質とのアッセイをアッセイするための定量的ビードベースのフローサイトメトリー

RAB7は、初期エンドソームから後期エンドソーム、および後期エンドソームからリソソームへの小胞輸送と送達を促進します。小胞輸送におけるRAB7の役割は、エフェクタータンパク質との相互作用、その中にはRAB相互作用リソソームタンパク質（RILP）に依存しており、これは、エンドソームの活性RAB7（GTPバウンド）の動員を促進し、後期エンドソソマール腫瘍を促進します。細胞骨格での輸送。ここでは、RAB7相互作用リソソームタンパク質（RILP）エフェクタータンパク質とのRAB7相互作用を測定するための新規ビーズベースのフローサイトメトリーアッセイについて詳しく説明し、定量的評価と薬物標的相互作用の研究のためのその有用性を実証します。GTP結合RAB7のRILPへの特異的結合は、容易に実証され、用量依存性で飽和可能であることが示され、K DおよびB MAXの測定が測定されます。さらに、結合はほぼ瞬間的で温度依存的です。アッセイ法の新規用途では、Rab7ヌクレオチド結合の競合小分子阻害剤（CID 1067700またはML282）がRab7-RILP相互作用を阻害することが示されています。したがって、このアッセイは、活性コンフォメーションを引き起こすのではなく、小分子を区別することができ、代わりに非アクティブな立体構造でGTPaseを「ロック」します。一緒に、この研究は、フローサイトメトリーアッセイを使用して、小さなGTPaseを含むタンパク質間相互作用を定量的に特徴づけ、ハイスループットスクリーニングに適応した有用性を示しています。さらに、この方法は、タンパク質間相互作用に小さな分子効果をテストするためのプラットフォームを提供します。これは、創薬と発達に関連することができます。

Rab7 facilitates vesicular transport and delivery from early endosomes to late endosomes as well as from late endosomes to lysosomes. The role of Rab7 in vesicular transport is dependent on its interactions with effector proteins, among them Rab-interacting lysosomal protein (RILP), which aids in the recruitment of active Rab7 (GTP-bound) onto dynein-dynactin motor complexes to facilitate late endosomal transport on the cytoskeleton. Here we detail a novel bead-based flow cytometry assay to measure Rab7 interaction with the Rab-interacting lysosomal protein (RILP) effector protein and demonstrate its utility for quantitative assessment and studying drug-target interactions. The specific binding of GTP-bound Rab7 to RILP is readily demonstrated and shown to be dose-dependent and saturable enabling K d and B max determinations. Furthermore, binding is nearly instantaneous and temperature-dependent. In a novel application of the assay method, a competitive small molecule inhibitor of Rab7 nucleotide binding (CID 1067700 or ML282) is shown to inhibit the Rab7-RILP interaction. Thus, the assay is able to distinguish that the small molecule, rather than incurring the active conformation, instead 'locks' the GTPase in the inactive conformation. Together, this work demonstrates the utility of using a flow cytometry assay to quantitatively characterize protein-protein interactions involving small GTPases and which has been adapted to high-throughput screening. Further, the method provides a platform for testing small molecule effects on protein-protein interactions, which can be relevant to drug discovery and development.