最大の感度、ダイナミックレンジ、測定精度のためのデジタルPCRモデリング

デジタルPCRの大きな約束は、遺伝的定量化のための正確な測定を可能にする比類のない精度の可能性です。不明なサンプルをテストする場合のデジタルPCR実験に関連する課題は、希望のレベルの精度で1つ以上の対象ターゲットを検出できる希釈で実験を行うことです。理論は、パーティションあたり〜1.59の平均コピー（λ）を標的とすることで最適な精度（PO）が達成され、ダイナミックレンジ（r）には、1つの正（λL）から1つのネガティブ（λU）に及ぶ空間が含まれていること（n）が含まれますが、これらの結果は、実験室でのデジタルPCR実験を構築しようとする実務家のために和らげられます。デジタルPCRの精度、ダイナミックレンジ、パーティションの数、尋問ボリューム、および感度の間の関係を解明する数学的枠組みが提示されます。誤った反応の呼び出しと体積変動が感度と精度に与える影響を次に考慮します。結果として生じる感度と精度への影響は、実験室でそのようなシナリオに遭遇する現実世界の可能性を反映したモンテカルロシミュレーションを介して確立されます。このシミュレーションは、実務家に実験的な負荷濃度を適応させて、これらの条件のいずれかに対抗する方法についての洞察を提供します。このフレームワークは、希釈を使用して、nを増加させずにデジタルPCRのダイナミックレンジを拡張する方法で補強されています。フレームワークの機能を示す実験の例は、開始コピー濃度の3.33ログにわたって検出を可能にします。

The great promise of digital PCR is the potential for unparalleled precision enabling accurate measurements for genetic quantification. A challenge associated with digital PCR experiments, when testing unknown samples, is to perform experiments at dilutions allowing the detection of one or more targets of interest at a desired level of precision. While theory states that optimal precision (Po) is achieved by targeting ~1.59 mean copies per partition (λ), and that dynamic range (R) includes the space spanning one positive (λL) to one negative (λU) result from the total number of partitions (n), these results are tempered for the practitioner seeking to construct digital PCR experiments in the laboratory. A mathematical framework is presented elucidating the relationships between precision, dynamic range, number of partitions, interrogated volume, and sensitivity in digital PCR. The impact that false reaction calls and volumetric variation have on sensitivity and precision is next considered. The resultant effects on sensitivity and precision are established via Monte Carlo simulations reflecting the real-world likelihood of encountering such scenarios in the laboratory. The simulations provide insight to the practitioner on how to adapt experimental loading concentrations to counteract any one of these conditions. The framework is augmented with a method of extending the dynamic range of digital PCR, with and without increasing n, via the use of dilutions. An example experiment demonstrating the capabilities of the framework is presented enabling detection across 3.33 logs of starting copy concentration.