ジシストロウイルスクリケット麻痺ウイルスの新規感染性分子クローンの5 '翻訳されていない領域は、感染を調節します

非標識：ジシストロビリダ科は、2つの異なるオープンリーディングフレーム（ORF）を含む一本鎖陽性陽性RNAゲノムを持つRNAウイルスのファミリーであり、それぞれがそれぞれウイルス構造タンパク質と非構造タンパク質の翻訳を駆動する内部リボソーム侵入部位が先行しています。。タイプの種であるクリケット麻痺ウイルス（CRPV）は、宿主とウイルスの相互作用を研究するためのモデルとして機能しています。しかし、CRPVおよび他のジシストロウイルスの分子メカニズムの調査は、確立された感染性クローンがとらえどころのないため、限られています。ここでは、CRPVの感染性分子クローンの構造を報告します。CRPVクローンからショウジョウバエシュナイダーライン2（S2）細胞へのin vitroで転写されたRNAのトランスフェクションは、細胞障害効果、ウイルスRNA蓄積、陰性ウイルスRNAの検出、およびウイルスタンパク質の発現をもたらしました。透過型電子顕微鏡、ウイルス力価、および免疫蛍光結合トランスウェルアッセイにより、感染性ウイルス粒子がトランスフェクトされた細胞から放出されることが示されました。対照的に、いずれかのORFに停止コドンを含む変異クローンは、ウイルス感染性を低下させました。CRPVクローンに由来するがUV不活性化クローンではなく、成人のショウジョウバエのハエの注射は、死亡率をもたらしました。CRPVクローンの分子分析により、レポーターコンストラクトの翻訳を刺激した5 '非翻訳領域（UTR）内で196ヌクレオチドの重複が明らかになりました。CRPVクローンに感染した細胞では、重複はウイルス感染性を阻害しましたが、ウイルス翻訳やRNAの蓄積には影響しませんでした。CRPV感染性クローンの生成は、ジシストロウイルスのウイルスライフサイクルと病因を調査するための強力なツールを提供し、昆虫細胞における基本的な宿主ウイルス相互作用をさらに理解する可能性があります。 重要性：節足動物に感染するRNAウイルスであるディシストロビリダ科は、昆虫細胞における基本的な宿主とウイルスの相互作用に関する洞察を得るためのモデルとして機能しました。確立された感染性クローンが不足しているため、ウイルス分子メカニズムに関するさらなる洞察が妨げられています。ジシストロウイルスの最初の感染性クローン、クリケット麻痺ウイルス（CRPV）の構造を報告します。CRPVクローンRNAのショウジョウバエ細胞へのトランスフェクションは、自然なCRPVビリオンに似た感染性粒子の産生をもたらし、感染細胞におけるCRPVタンパク質とRNAの細胞パシー効果と発現をもたらすことを示しています。CRPVクローンは、昆虫細胞におけるジシストロウイルスのライフサイクルと宿主ウイルス相互作用に関する洞察を提供するはずです。このクローンを使用して、CRPVクローンの5 '非翻訳領域内の196ヌクレオチドの重複は、レポーターコンストラクトのウイルス翻訳を増加させたが、ウイルス感染性を低下させ、ウイルス翻訳と複製を相互作用するバランスを明らかにすることがわかります。

UNLABELLED: Dicistroviridae are a family of RNA viruses that possesses a single-stranded positive-sense RNA genome containing two distinct open reading frames (ORFs), each preceded by an internal ribosome entry site that drives translation of the viral structural and nonstructural proteins, respectively. The type species, Cricket paralysis virus (CrPV), has served as a model for studying host-virus interactions; however, investigations into the molecular mechanisms of CrPV and other dicistroviruses have been limited as an established infectious clone was elusive. Here, we report the construction of an infectious molecular clone of CrPV. Transfection of in vitro-transcribed RNA from the CrPV clone into Drosophila Schneider line 2 (S2) cells resulted in cytopathic effects, viral RNA accumulation, detection of negative-sense viral RNA, and expression of viral proteins. Transmission electron microscopy, viral titers, and immunofluorescence-coupled transwell assays demonstrated that infectious viral particles are released from transfected cells. In contrast, mutant clones containing stop codons in either ORF decreased virus infectivity. Injection of adult Drosophila flies with virus derived from CrPV clones but not UV-inactivated clones resulted in mortality. Molecular analysis of the CrPV clone revealed a 196-nucleotide duplication within its 5' untranslated region (UTR) that stimulated translation of reporter constructs. In cells infected with the CrPV clone, the duplication inhibited viral infectivity yet did not affect viral translation or RNA accumulation, suggesting an effect on viral packaging or entry. The generation of the CrPV infectious clone provides a powerful tool for investigating the viral life cycle and pathogenesis of dicistroviruses and may further understanding of fundamental host-virus interactions in insect cells. IMPORTANCE: Dicistroviridae, which are RNA viruses that infect arthropods, have served as a model to gain insights into fundamental host-virus interactions in insect cells. Further insights into the viral molecular mechanisms are hampered due to a lack of an established infectious clone. We report the construction of the first infectious clone of the dicistrovirus, cricket paralysis virus (CrPV). We show that transfection of the CrPV clone RNA into Drosophila cells led to production of infectious particles that resemble natural CrPV virions and result in cytopathic effects and expression of CrPV proteins and RNA in infected cells. The CrPV clone should provide insights into the dicistrovirus life cycle and host-virus interactions in insect cells. Using this clone, we find that a 196-nucleotide duplication within the 5' untranslated region of the CrPV clone increased viral translation in reporter constructs but decreased virus infectivity, thus revealing a balance that interplays between viral translation and replication.