プロテインキナーゼアッセイ用の単一量子ドットベースのナノセンサーのリン酸化指向アセンブリ

プロテインキナーゼは、細胞内シグナル伝達と代謝経路で重要な役割を果たし、プロテインキナーゼ活性のモニタリングは、基本的な生化学プロセスと臨床診断の理解に不可欠です。ここでは、cAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）の感度検出のための単一量子ドット（QD）ベースのナノセンサーのリン酸化指向アセンブリを示します。このアッセイには、（1）シアニン5（CY5）標識基質ペプチドのPKA指向の同時リン酸化とビオチン化が含まれます。アデノシン三リン酸（ATP）類似体、γ-ビオチン-ATPを使用して、ホスホリルドナーとして、PKA触媒リン酸化反応はビオチン結合リン酸グループを基質ペプチドに組み込み、ビオチン化ペプチドを形成します。その後、ビオチンエンティティは、ペプチドのアセンブリをストレプトアビジン官能化QDの表面に駆動して、サンドイッチされたCy5ペプチド-QDナノ構造を形成し、QDとCy5の間でFRETの発生を可能にします。FRET信号は、従来の蛍光分光計または総内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡のいずれかによって簡単に記録できます。対照的に、PKAの存在はCy5-ペプチド-QD複合体の形成につながることができず、Cy5シグナルは検出できません。このプロテインキナーゼ作動済みFRETアッセイは、洗浄ステップまたは分離ステップのいずれかの関与なしに簡単であり、9.3×10（-6）U/μLの検出限界で高感度の大きな利点があります。Moreover, this method can be used to estimate the half-maximal inhibitory concentration (IC50) value of PKA inhibitor H-89 (N-[2-(p-bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide dihydrochloride) and to monitor forskolin (Fsk)/3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX） - 細胞溶解物におけるPKAのトリガーされた活性化により、プロテインキナーゼ関連の生物学的研究と薬物発見におけるさらなる応用の大きな可能性があります。

Protein kinases play crucial roles in intracellular signal transduction and metabolic pathways, and the monitoring of protein kinase activity is essential to the understanding of fundamental biochemical processes and the clinical diagnosis. Here, we demonstrate the phosphorylation-directed assembly of a single quantum dot (QD)-based nanosensor for sensitive detection of cAMP-dependent protein kinase (PKA). This assay involves (1) the PKA-directed simultaneous phosphorylation and biotinylation of cyanine 5 (Cy5)-labeled substrate peptides, (2) the assembly of phosphorylated and biotinylated peptides onto the surface of the QD, and (3) the illumination of Cy5 by means of fluorescence resonance energy transfer (FRET) between the QD and Cy5. With an adenosine triphosphate (ATP) analogue, γ-biotin-ATP, as the phosphoryl donor, the PKA-catalyzed phosphorylation reaction incorporates the biotin-conjugated phosphate group into the substrate peptides to form the biotinylated peptides. The biotin entity subsequently drives the assembly of peptides onto the surface of streptavidin-functionalized QD to form the sandwiched Cy5-peptide-QD nanostructure, enabling the occurrence of FRET between the QD and Cy5. The FRET signal can be easily recorded by either the conventional fluorescence spectrometer or the total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope. In contrast, the absence of PKA cannot lead to the formation of Cy5-peptide-QD complex and no Cy5 signal can be detected. This protein kinase-actuated FRET assay is straightforward, without the involvement of either washing or separation steps, and has a significant advantage of high sensitivity with a detection limit of 9.3 × 10(-6) U/μL. Moreover, this method can be used to estimate the half-maximal inhibitory concentration (IC50) value of PKA inhibitor H-89 (N-[2-(p-bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide dihydrochloride) and to monitor forskolin (Fsk)/3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)-triggered activation of PKA in cell lysates, thus holding great potential for further applications in protein kinase-related biological researches and drug discovery.