LC-UV-MSによるヒト血漿中のオキシステロール、コレステロール、25-ヒドロキシ - ビタミンD3の同時測定

背景：オキシステロールは、コレステロールおよびビタミンD代謝に関連する神経変性疾患の有望なバイオマーカーです。複数のオキシステロール、ビタミンD、コレステロール経路のバイオマーカーの敏感で同時に定量できる方法が満たされていない必要性があります。 方法：ヒト血漿中の5つの主要なオキシステロール、25-ヒドロキシビタミンD3およびコレステロールを同時に測定する方法が開発されました。総オキシステロールは、室温の腐敗により調製され、その後、重水素化内部標準でスパイクされた血漿からの固相抽出が行われました。オキシステロールは、メタノール/水/0.1％ギ酸勾配を使用して逆相HPLCによって分解されました。オキシステロールと25-ヒドロキシビタミンD3は、陽性イオンモードでの大気圧化学イオン化質量分析で検出されました。204nmでのシリーズのフォトダイオードアレイ検出は、コレステロールに使用されました。メソッド検証研究が実行されました。健康な対照被験者、多発性硬化症、およびその他の神経障害患者からの220の血漿サンプルのオキシステロールレベルが定量化されました。 結果：私たちの方法は、35分で200μLの血漿から5つのオキシステロール、コレステロール、25-ヒドロキシビタミンD3を定量化しました。回収率は、すべての分析物と内部基準で85％以上でした。検出限界は、オキシステロールの場合は3〜10 ng/ml、コレステロールの同時検出では25-ヒドロキシビタミンD3および1μg/mLでした。分析的不正確さは、24（S） - 25、27-、7α-ヒドロキシコレステロール（HC）およびコレステロール、7-ケトコレステロールで15％以下で<10％CVでした。多発性硬化症および他の神経障害患者は、コントロールと比較して27-ヒドロキシコレステロールレベルが低かったのに対し、7α-ヒドロキシコレステロールは多発性硬化症では特に低かった。 結論：この方法は、人間の健康と病気における血漿オキシステロールレベルの測定に適しています。ヒト血漿の分​​析は、オキシステロール、胆汁酸前駆体7α-ヒドロキシコレステロールと27-ヒドロキシコレステロールが多発性硬化症で低く、疾患の潜在的なバイオマーカーとして機能する可能性があることを示しています。

BACKGROUND: Oxysterols are promising biomarkers of neurodegenerative diseases that are linked with cholesterol and vitamin D metabolism. There is an unmet need for methods capable of sensitive, and simultaneous quantitation of multiple oxysterols, vitamin D and cholesterol pathway biomarkers. METHODS: A method for simultaneous determination of 5 major oxysterols, 25-hydroxy vitamin D3 and cholesterol in human plasma was developed. Total oxysterols were prepared by room temperature saponification followed by solid phase extraction from plasma spiked with deuterated internal standards. Oxysterols were resolved by reverse phase HPLC using a methanol/water/0.1% formic acid gradient. Oxysterols and 25-hydroxy vitamin D3 were detected with atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry in positive ion mode; in-series photodiode array detection at 204nm was used for cholesterol. Method validation studies were performed. Oxysterol levels in 220 plasma samples from healthy control subjects, multiple sclerosis and other neurological disorders patients were quantitated. RESULTS: Our method quantitated 5 oxysterols, cholesterol and 25-hydroxy vitamin D3 from 200 μL plasma in 35 minutes. Recoveries were >85% for all analytes and internal standards. The limits of detection were 3-10 ng/mL for oxysterols and 25-hydroxy vitamin D3 and 1 μg/mL for simultaneous detection of cholesterol. Analytical imprecision was <10 %CV for 24(S)-, 25-, 27-, 7α-hydroxycholesterol (HC) and cholesterol and ≤15 % for 7-keto-cholesterol. Multiple Sclerosis and other neurological disorder patients had lower 27-hydroxycholesterol levels compared to controls whereas 7α-hydroxycholesterol was lower specifically in Multiple Sclerosis. CONCLUSION: The method is suitable for measuring plasma oxysterols levels in human health and disease. Analysis of human plasma indicates that the oxysterol, bile acid precursors 7α-hydroxycholesterol and 27-hydroxycholesterol are lower in Multiple Sclerosis and may serve as potential biomarkers of disease.