トポイソメラーゼI単独では、短いDNA欠失を生成するのに十分であり、リボヌクレオチド部位でニックを逆転させることもできます

リボヌクレオチドモノリン酸（RNMP）は、リボヌクレオチド三リン酸の比率が高いため、DNAの最も頻繁な形態のDNA異常の1つです。RNMPを除去するための主な経路は、RNase H2によるものです。ただし、RNase H2ノックアウト酵母株では、トポイソメラーゼI（TOP1）依存性変異体効果が、タンデムリピート内の短い欠失の蓄積とともに発生します。これらの削除の提案されたモデルは、RNMPサイトおよび/またはシーケンシャルトップ1結合でのTOP1生成ニックの処理を含みましたが、これまでのところ実験的サポートが不足しています。ここでは、ニックサイトで2 '、3'環状リン酸塩を持つニック付きDNA基質を生成し、トップ1誘発ニックを模倣することにより、RNMP部位でトップ1誘発性短縮の生化学的メカニズムを調査しました。ニックに隣接する2番目のTop1切断複合体とその後の故障したTop1リラージングが短い削除につながったことを実証します。さらに、2 '、3'-環状リン酸塩を含むニック付きDNA基質に作用すると、Top1は短い欠失だけでなく、全長の宗教DNA産物も生成しました。触媒的に不活性なTOP1変異体（TOP1-Y723F）も全長産物を誘導し、その酵素活性とは無関係にTop1結合が、2 '、3'の5'-ヒドロキシルによる核酸菌攻撃を介してDNA骨格のシールを促進することを示しています。環状リン酸。再シールされたDNAは、in vivoでのエラーのないRNase H2依存性経路による修復の新たな試みを可能にします。私たちの結果は、順次Top1切断イベントによる短い削除の生成と、TOP1によるRNMPサイトでのニックリラージングの促進に関する直接的な証拠を提供します。

Ribonucleotide monophosphates (rNMPs) are among the most frequent form of DNA aberration, as high ratios of ribonucleotide triphosphate:deoxyribonucleotide triphosphate pools result in approximately two misincorporated rNMPs/kb of DNA. The main pathway for the removal of rNMPs is by RNase H2. However, in a RNase H2 knock-out yeast strain, a topoisomerase I (Top1)-dependent mutator effect develops with accumulation of short deletions within tandem repeats. Proposed models for these deletions implicated processing of Top1-generated nicks at rNMP sites and/or sequential Top1 binding, but experimental support has been lacking thus far. Here, we investigated the biochemical mechanism of the Top1-induced short deletions at the rNMP sites by generating nicked DNA substrates bearing 2',3'-cyclic phosphates at the nick sites, mimicking the Top1-induced nicks. We demonstrate that a second Top1 cleavage complex adjacent to the nick and subsequent faulty Top1 religation led to the short deletions. Moreover, when acting on the nicked DNA substrates containing 2',3'-cyclic phosphates, Top1 generated not only the short deletion, but also a full-length religated DNA product. A catalytically inactive Top1 mutant (Top1-Y723F) also induced the full-length products, indicating that Top1 binding independent of its enzymatic activity promotes the sealing of DNA backbones via nucleophilic attacks by the 5'-hydroxyl on the 2',3'-cyclic phosphate. The resealed DNA would allow renewed attempt for repair by the error-free RNase H2-dependent pathway in vivo. Our results provide direct evidence for the generation of short deletions by sequential Top1 cleavage events and for the promotion of nick religation at rNMP sites by Top1.