ノルボルネン基質とその後の逆電子需要Diels-Alder反応を伴うリポ酸リガーゼを使用した2段階のタンパク質標識

緊張したアルケンとテトラジンの間の逆電子需要のディールスアルダー環状付加（DAINV）は、生体分子の特定の標識に適用された非常に生物検正孔反応です。この研究では、酵素リポ酸リガーゼA（LPLA（W37V））の変異体を使用して、高度に安定したノルボルネン誘導体の特定のペプチド配列への付着に基づいて、タンパク質の部位固有の標識のための2段階の標識プロトコルを提示します。、続いて、生物系統dainvを介してノルボルネン部分にテトラジン修飾フルオロフォアの共有結合を付着させます。標準化されたHPLCプロトコルを使用して、13レシドリポ酸アクセプターペプチド（LAP）への選択的酵素付着について、15種類のノルボルネン誘導体を調査しました。最後に、この2段階の標識戦略を使用して、サイト固有の方法で細胞溶解物のタンパク質を標識し、生細胞で細胞表面標識を実行しました。

Inverse-electron-demand Diels-Alder cycloaddition (DAinv ) between strained alkenes and tetrazines is a highly bio-orthogonal reaction that has been applied in the specific labeling of biomolecules. In this work we present a two-step labeling protocol for the site-specific labeling of proteins based on attachment of a highly stable norbornene derivative to a specific peptide sequence by using a mutant of the enzyme lipoic acid ligase A (LplA(W37V) ), followed by the covalent attachment of tetrazine-modified fluorophores to the norbornene moiety through the bio-orthogonal DAinv  . We investigated 15 different norbornene derivatives for their selective enzymatic attachment to a 13-residue lipoic acid acceptor peptide (LAP) by using a standardized HPLC protocol. Finally, we used this two-step labeling strategy to label proteins in cell lysates in a site-specific manner and performed cell-surface labeling on living cells.