機能的な環状HSV1-TKレポーターの設計とアポトーシスのペットイメージングへの応用

ポジトロン放出断層撮影（PET）は、生きている被験者の分子イベントを探索するために広く使用されている敏感で非侵襲的なイメージング法です。PETは、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす細胞アポトーシスを正確かつ定量的に評価できます。このプロトコルでは、アポトーシスによってキナーゼ活性が特異的にオンになっている、操作された環状ヘルペスシンプレックスウイルス1-チミジンキナーゼ（HSV1-TK）PETレポーターの設計と使用について説明します。健康な細胞における環状TK（CTK）の発現は不活性産物につながりますが、カスパーゼ-3経路を介したアポトーシスの活性化はCTKを切断し、その活性を回復し、PETイメージングを可能にします。このプロトコルにおけるCTKプラスミドの設計と構造の詳細に加えて、アポトーシス細胞におけるPETトレーサーの細胞取り込みを測定するためのアッセイ、ドキソルビシンの相関関係など、アポトーシス細胞におけるCTKレポーターの機能と特異性を評価するためのアッセイを含めます。（DOX） - CTK機能回復に対する誘発細胞アポトーシス、および癌細胞アポトーシスのin vivo PETイメージング、および対応するデータ収集方法も含めます。CTKレポーター全体を構築する時間は約2〜3週間です。安定した癌細胞株の選択には約4〜6週間かかります。アポトーシス細胞とin vivoイメージングのCTK機能に関するアッセイを実装する時間は、実験によって異なります。このプロトコルに記載されている環化戦略は、幅広い生物医学用途向けの他のレポーターシステムを作成するためにも適応できます。

Positron emission tomography (PET) is a sensitive and noninvasive imaging method that is widely used to explore molecular events in living subjects. PET can precisely and quantitatively evaluate cellular apoptosis, which has a crucial role in various physiological and pathological processes. In this protocol, we describe the design and use of an engineered cyclic herpes simplex virus 1-thymidine kinase (HSV1-TK) PET reporter whose kinase activity is specifically switched on by apoptosis. The expression of cyclic TK (cTK) in healthy cells leads to inactive product, whereas the activation of apoptosis through the caspase-3 pathway cleaves cTK, thus restoring its activity and enabling PET imaging. In addition to detailing the design and construction of the cTK plasmid in this protocol, we include assays for evaluating the function and specificity of the cTK reporter in apoptotic cells, such as assays for measuring the cell uptake of PET tracer in apoptotic cells, correlating doxorubicin (Dox)-induced cell apoptosis to cTK function recovery, and in vivo PET imaging of cancer cell apoptosis, and we also include corresponding data acquisition methods. The time to build the entire cTK reporter is ∼2-3 weeks. The selection of a stable cancer cell line takes ∼4-6 weeks. The time to implement assays regarding cTK function in apoptotic cells and the in vivo imaging varies depending on the experiment. The cyclization strategy described in this protocol can also be adapted to create other reporter systems for broad biomedical applications.