ジスルフィラムはin vitroで破骨細胞の分化を減衰させる：潜在的な抗吸収剤

システイン修飾化合物であるディスルフィラム（DSF）は、アルコール中毒の治療に臨床的に長い間採用されてきました。機械的には、DSFはMAPKおよびNF-κB経路シグナル伝達経路の変調器として機能します。これらの経路は破骨細胞（OC）の分化にとって重要ですが、OC形成と機能に対するDSFの潜在的な影響は直接評価されていません。ここでは、OCの分化、活性、骨形成性シグナル伝達カスケードの変調に対するDSFの薬理学的効果を調査します。最初に、C57BL/6Jマウスから分離された骨髄単球上のDSFの細胞毒性を分析しました。最適な投与量が確立されると、DSF治療の存在下または非存在下で破骨細胞形成と骨吸収アッセイを実施しました。RAW264.7細胞のルシフェラーゼアッセイを使用して、主要な転写因子の活性化に対するDSFの効果を調べました。ウエスタンブロット、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、細胞内酸性化、およびプロトン流入アッセイを使用して、基礎となるメカニズムをさらに解剖しました。DSF治療は、特に分化の初期段階で、マウスとヒトの骨形成形成の両方を用量依存的に阻害しました。この阻害は、CTSK、TRAP、DCスタンプ、ATP6V0D2を含む重要な破骨細胞マーカー遺伝子の発現の減少と、in vitroでの骨吸収の減少と相関していました。OC分化の抑制は、少なくとも部分的には、ERK、NF-κB、NFATC1を含む核因子Kappa-Bリガンド（RANKL）シグナル伝達経路のいくつかの重要な受容体活性化因子の遮断によるものであることがわかりました。一方、DSFは、アクリジンオレンジクエンチングとミクロソームベースのプロトン輸送アッセイを使用して、マウスおよびヒトの破骨細胞における細胞内酸性化とプロトンの流入を抑制できませんでした。我々の発見は、DSFがいくつかの重要なRANKLを介したシグナル伝達カスケードの集合的抑制を介してOC分化を減衰させ、したがって、OCを介した障害の治療に魅力的な薬剤となっていることを示しています。

Disulfiram (DSF), a cysteine modifying compound, has long been clinically employed for the treatment of alcohol addiction. Mechanistically, DSF acts as a modulator of MAPK and NF-κB pathways signaling pathways. While these pathways are crucial for osteoclast (OC) differentiation, the potential influence of DSF on OC formation and function has not been directly assessed. Here, we explore the pharmacological effects of DSF on OC differentiation, activity and the modulation of osteoclastogenic signaling cascades. We first analyzed cytotoxicity of DSF on bone marrow monocytes isolated from C57BL/6J mice. Upon the establishment of optimal dosage, we conducted osteoclastogenesis and bone resorption assays in the presence or absence of DSF treatment. Luciferase assays in RAW264.7 cells were used to examine the effects of DSF on major transcription factors activation. Western blot, reverse transcription polymerase chain reaction, intracellular acidification and proton influx assays were employed to further dissect the underlying mechanism. DSF treatment dose-dependently inhibited both mouse and human osteoclastogenesis, especially at early stages of differentiation. This inhibition correlated with a decrease in the expression of key osteoclastic marker genes including CtsK, TRAP, DC-STAMP and Atp6v0d2 as well as a reduction in bone resorption in vitro. Suppression of OC differentiation was found to be due, at least in part, to the blockade of several key receptor activators of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)-signaling pathways including ERK, NF-κB and NFATc1. On the other hand, DSF failed to suppress intracellular acidification and proton influx in mouse and human osteoclasts using acridine orange quenching and microsome-based proton transport assays. Our findings indicate that DSF attenuates OC differentiation via the collective suppression of several key RANKL-mediated signaling cascades, thus making it an attractive agent for the treatment of OC-mediated disorders.