一本鎖オリゴヌクレオチドとCRISPR/CAS9システムが指示する遺伝子編集活性の調節

一本鎖DNAオリゴヌクレオチド（SSODNS）は、ヒト遺伝子の単一の塩基突然変異の修復を指示できます。この遺伝子編集反応の調節は部分的に解明されていますが、修復が起こる低頻度では、臨床応用への発達を妨げています。この研究では、CRISPR/Cas9複合体が使用され、交換用に指定されたヌクレオチドを囲む特定の部位で二重鎖DNA破損を誘導します。その結果、表現型の読み出しによって検証されたSSODN指向遺伝子修復の大幅な上昇が得られます。反応パラメーターを分析することにより、CRISPR/Cas9複合体を含む遺伝子編集活性に関する制限を明らかにしました。第一に、転写されていない鎖にハイブリダイズするSSODNは、転写された鎖にハイブリダイズするものよりも高いレベルの遺伝子修復を指示します。第二に、切断は、より高いレベルの遺伝子編集を可能にするために、標的変異塩基の近位でなければなりません。第三に、DNA切断は、修正されたCAS9（ニッケース）によって作成された一本鎖DNAニックと比較して、より高いレベルの遺伝子編集活性を可能にします。第4に、この研究で使用したCRISPRのガイドRNA配列を相補的なSSODNのハイブリダイゼーションポテンシャルと自由エネルギーレベルを計算しました。自由エネルギーの電位と、特定のDNA切断活性を阻害する一本鎖オリゴヌクレオチドの能力との間に相関があり、それにより遺伝子編集活性が間接的に減少します。私たちのデータは、遺伝子編集用のSSODNを使用したCRISPR/CAS9システムの設計と使用において考慮される可能性のある新しい情報を提供します。

Single-stranded DNA oligonucleotides (ssODNs) can direct the repair of a single base mutation in human genes. While the regulation of this gene editing reaction has been partially elucidated, the low frequency with which repair occurs has hampered development toward clinical application. In this work a CRISPR/Cas9 complex is employed to induce double strand DNA breakage at specific sites surrounding the nucleotide designated for exchange. The result is a significant elevation in ssODN-directed gene repair, validated by a phenotypic readout. By analysing reaction parameters, we have uncovered restrictions on gene editing activity involving CRISPR/Cas9 complexes. First, ssODNs that hybridize to the non-transcribed strand direct a higher level of gene repair than those that hybridize to the transcribed strand. Second, cleavage must be proximal to the targeted mutant base to enable higher levels of gene editing. Third, DNA cleavage enables a higher level of gene editing activity as compared to single-stranded DNA nicks, created by modified Cas9 (Nickases). Fourth, we calculated the hybridization potential and free energy levels of ssODNs that are complementary to the guide RNA sequences of CRISPRs used in this study. We find a correlation between free energy potential and the capacity of single-stranded oligonucleotides to inhibit specific DNA cleavage activity, thereby indirectly reducing gene editing activity. Our data provide novel information that might be taken into consideration in the design and usage of CRISPR/Cas9 systems with ssODNs for gene editing.