好中球セリンプロテアーゼは、内皮細胞にタンパク質分解活性を発揮します

好中球セリンプロテアーゼ（NSP）は、炎症中に活性化された好中球から放出されます。ここでは、3つの主要なNSP、すなわちプロテイナーゼ3、ヒト好中球エラスターゼ、およびカテプシンGの移動を、好中球から内皮細胞へと研究し、偏りのないアプローチを使用して新規内皮NSP基質を特定しました。酵素的に活性なNSPは、刺激された好中球から放出され、免疫ブロット、フローサイトメトリー、およびBOC-ALA基質アッセイによって示されるように、用量および時間依存的に内皮細胞によって内在化されました。内皮細胞における基質の末端 - アミン同位体標識を使用して、プロテイナーゼ3の36基質、好中球エラスターゼ用30、カテプシンGの28から構成される82種類のタンパク質から121ペプチドを同定しました。拡張された切断パターンを特徴づけ、対応する氷石を提供しました。遺伝子オントロジー分析では、有意な細胞骨格基質濃縮が示され、免疫ブロッティングによりいくつかの細胞骨格タンパク質基質が確認されました。最後に、ANCA刺激された好中球は、3つの活性NSPすべてを上清に放出しました。上清は、内皮アルブミンフラックスを増加させ、内皮細胞の細胞骨格構造を乱しました。セリンプロテアーゼ阻害はこの効果を無効にしました。NSPへの長時間の曝露により、内皮細胞の生存率が低下し、アポトーシスが増加しました。したがって、我々は新規NSP基質を特定し、NSP阻害は好中球を介した炎症性血管疾患を阻害する治療尺度として示唆した。

Neutrophil serine proteases (NSPs) are released from activated neutrophils during inflammation. Here we studied the transfer of the three major NSPs, namely proteinase 3, human neutrophil elastase, and cathepsin G, from neutrophils to endothelial cells and used an unbiased approach to identify novel endothelial NSP substrates. Enzymatically active NSPs were released from stimulated neutrophils and internalized by endothelial cells in a dose- and time-dependent manner as shown by immunoblotting, flow cytometry, and the Boc-Ala substrate assay. Using terminal-amine isotopic labeling of substrates in endothelial cells, we identified 121 peptides from 82 different proteins consisting of 36 substrates for proteinase 3, 30 for neutrophil elastase, and 28 for cathepsin G, respectively. We characterized the extended cleavage pattern and provide corresponding IceLogos. Gene ontology analysis showed significant cytoskeletal substrate enrichment and confirmed several cytoskeletal protein substrates by immunoblotting. Finally, ANCA-stimulated neutrophils released all three active NSPs into the supernatant. Supernatants increased endothelial albumin flux and disturbed the endothelial cell cytoskeletal architecture. Serine protease inhibition abrogated this effect. Longer exposure to NSPs reduced endothelial cell viability and increased apoptosis. Thus, we identified novel NSP substrates and suggest NSP inhibition as a therapeutic measure to inhibit neutrophil-mediated inflammatory vascular diseases.