透過性細胞、組織ホモジネート、および分離ミトコンドリアにおける酸素と過酸化水素フラックスの同時測定のための高解像度応答測定

ミトコンドリアは酸化リン酸化（oxphos）のATPの源として十分に確立されていますが、それらが反応性酸素種（ROS）の主要な細胞源でもあるかどうかは議論されています。ここでは、ミトコンドリア調製物（透過性細胞、組織ホモジネート、分離ミトコンドリア）に適用される、過酸化水素（H2O2）産生の高解像度の呼吸器と蛍光測定を組み合わせるという新しいアプローチについて説明します。広く使用されているH2O2プローブは、無傷および透過化された細胞で呼吸を阻害し、10 µmを超える濃度で適用すべきではありません。H2O2フラックスは、一般に、生理学的基質およびカップリング状態、特に透過性細胞の酸素フラックスの1％未満でした。H2O2フラックスは、複合体II結合漏れ状態で一貫して最高であり、CI＆IIに関連する収束電子流量とオックスフォス容量でのミトコンドリアの呼吸で減少し、電子移動システム容量での共役ミトコンドリアの呼吸でさらに減少しました。ミトコンドリア呼吸とH2O2フラックスの同時測定には、アッセイ条件の慎重な最適化が必要であり、ROS生産の個別の分析を超えたミトコンドリア機能に関する情報を明らかにします。

Whereas mitochondria are well established as the source of ATP in oxidative phosphorylation (OXPHOS), it is debated if they are also the major cellular sources of reactive oxygen species (ROS). Here we describe the novel approach of combining high-resolution respirometry and fluorometric measurement of hydrogen peroxide (H2O2) production, applied to mitochondrial preparations (permeabilized cells, tissue homogenate, isolated mitochondria). The widely used H2O2 probe Amplex Red inhibited respiration in intact and permeabilized cells and should not be applied at concentrations above 10 µM. H2O2 fluxes were generally less than 1% of oxygen fluxes in physiological substrate and coupling states, specifically in permeabilized cells. H2O2 flux was consistently highest in the Complex II-linked LEAK state, reduced with CI&II-linked convergent electron flow and in mitochondria respiring at OXPHOS capacity, and were further diminished in uncoupled mitochondria respiring at electron transfer system capacity. Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and H2O2 flux requires careful optimization of assay conditions and reveals information on mitochondrial function beyond separate analysis of ROS production.