高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析による末梢血単核細胞におけるミルテフォシンの定量化

リーシュマニア寄生虫が存在する生理学的コンパートメントである食細胞は、薬物ミルテフォシンの主要な作用部位ですが、ミルテフォシンの細胞内薬物動態は未開拓のままです。既存の高性能液体クロマトグラフィータンデム質量分析法から、血漿中のミルテフォシンの定量化のために拡大して、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）のミルテフォシンを定量化するための生体分析法を開発しました。この方法は、内部標準として重水素化ミルテフォシンを導入しました。62.5％メタノールを添加することにより、ミルテフォシンをPBMCペレットから抽出しました。上清を収集し、蒸発させ、血漿で再構成しました。クロマトグラフィー分離は、逆位相C18カラムとトリプルクアドゥポール質量分析計による検出で実行されました。ミルテフォシンは、4〜1000ng/mlの範囲のプラズマキャリブレーション標準を使用して定量化されました。この方法は、PBMCマトリックス効果、選択性、回復、安定性に関して検証されました。PBMC含有量（0.17〜26.3×10（6）PBMCSの範囲の範囲）からマトリックス効果は観察できませんでした。品質制御サンプルは公称濃度の3.0％以内でした（精度は7.7％未満）。典型的な臨床サンプルの0.12Ng/10（6）PBMCに対応する4 ng/mLプラズマの定量の下限で、測定された濃度は公称値の8.6％以内でした。回復は、治療前の手順を追加しても9％以上で回復を増加させないため、再現性があることが示されました。この方法は、治療後1か月までの6人の皮膚リーシュマニア症患者からPBMCサンプルの細胞内ミルテフォシン濃度を測定するために正常に適用されました。

Phagocytes, the physiological compartment in which Leishmania parasites reside, are the main site of action of the drug miltefosine, but the intracellular pharmacokinetics of miltefosine remain unexplored. We developed a bioanalytical method to quantify miltefosine in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), expanding from an existing high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the quantification of miltefosine in plasma. The method introduced deuterated miltefosine as an internal standard. Miltefosine was extracted from PBMC pellets by addition of 62.5% methanol. Supernatant was collected, evaporated and reconstituted in plasma. Chromatographic separation was performed on a reversed phase C18 column and detection with a triple-quadrupole mass spectrometer. Miltefosine was quantified using plasma calibration standards ranging from 4 to 1000ng/mL. This method was validated with respect to its PBMC matrix effect, selectivity, recovery and stability. No matrix effect could be observed from the PBMC content (ranging from 0.17 to 26.3×10(6)PBMCs) reconstituted in plasma, as quality control samples were within 3.0% of the nominal concentration (precision less than 7.7%). At the lower limit of quantitation of 4 ng/mL plasma, corresponding to 0.12ng/10(6) PBMCs in a typical clinical sample, measured concentrations were within 8.6% of the nominal value. Recovery showed to be reproducible as adding additional pre-treatment steps did not increase the recovery with more than 9%. This method was successfully applied to measure intracellular miltefosine concentrations in PBMC samples from six cutaneous leishmaniasis patients up to one month post-treatment.