ヒトサイトメガロウイルスのPUL69は、mRNA輸出と効率的なウイルス複製に重要なドメインを介して、細胞タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ6を補充します。

非標識：ヒトサイトメガロウイルスの調節タンパク質Pul69は、ウイルスmRNA輸出因子として作用し、細胞mRNA輸出因子UAP56との相互作用を介してスプライシングされていないRNAの細胞質蓄積を促進します。ここでは、機能的に重要なN末端内のアルギニンメチル化を介したPul69の翻訳後修飾の証拠を提供します。まず、モノ/ジメチルアルギニン特異的抗体により、完全長Pul69およびPul69AA1-146の特定の免疫沈降を実証しました。第二に、触媒活性タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ6（PRMT6）の過剰発現により、特定の電気泳動移動度シフトが観察されました。第三に、Pul69とPrmt6の直接的な相互作用が、酵母の2ハイブリッドおよび共免疫沈降分析によって確認されました。PRMT6相互作用モチーフをPul69 N末端にマッピングし、PRMT6および/またはUAP56リクルートメントにとって重要なPul69のアルギニンリッチR1ボックス内の重要なアミノ酸を特定しました。Pul69の機能に対する推定メチル化基質の影響をテストするために、アルギニンからアラニンへの置換を抱えるさまざまなPul69誘導体を構築し、RNA輸出活性についてそれらをテストしました。したがって、UAP56/PRMT6の相互作用および/またはmRNA輸出活性にとって重要なPul69のR1ボックス内のアルギニンを区別することができました。驚くべきことに、核磁気共鳴（NMR）分析により、野生型R1/R2ボックスまたはUAP56/PRMT6結合欠損誘導体のいずれかをコードするPUL69配列の同じαヘリック構造が明らかになり、それによってR/Aアミノ酸代用の可能性を除外しました。R1は、Pul69の二次構造に影響を与えました。したがって、Pul69 N末端はPRMT6によってメチル化されており、これがヒトサイトメガロウイルスの効率的なmRNA輸出と複製のためにPul69の機能に大きく影響すると結論付けています。 重要性：ヒトサイトメガロウイルスのUL69タンパク質は、効率的な複製のために重要な役割を果たすウイルスRNA輸出因子として作用する多機能調節タンパク質です。ここでは、Pul69がアルギニンメチル化を介して翻訳後に修飾され、タンパク質メチルトランスフェラーゼPRMT6がこの修飾を媒介することを実証します。さらに、RNA輸出および細胞RNA輸出因子UAP56およびPRMT6の結合に重要な機能を備えたアルギニン残基は、Pul69のアルギニンに富むR1モチーフ内にマッピングされました。重要なことに、これらのアルギニンの変異はR1の二次構造を変化させず、それらが重要なメチル化基質として機能する可能性があることを示唆していることを実証しました。要約すると、我々の研究では、この重要なウイルス調節タンパク質の機能に大きな影響を与えるPul69の新しい翻訳後修飾が明らかになりました。PRMTは小分子による選択的阻害に適しているように見えるため、これは抗ウイルス療法の新しい標的を構成する可能性があります。

UNLABELLED: The regulatory protein pUL69 of human cytomegalovirus acts as a viral mRNA export factor, facilitating the cytoplasmic accumulation of unspliced RNA via interaction with the cellular mRNA export factor UAP56. Here we provide evidence for a posttranslational modification of pUL69 via arginine methylation within the functionally important N terminus. First, we demonstrated a specific immunoprecipitation of full-length pUL69 as well as pUL69aa1-146 by a mono/dimethylarginine-specific antibody. Second, we observed a specific electrophoretic mobility shift upon overexpression of the catalytically active protein arginine methyltransferase 6 (PRMT6). Third, a direct interaction of pUL69 and PRMT6 was confirmed by yeast two-hybrid and coimmunoprecipitation analyses. We mapped the PRMT6 interaction motif to the pUL69 N terminus and identified critical amino acids within the arginine-rich R1 box of pUL69 that were crucial for PRMT6 and/or UAP56 recruitment. In order to test the impact of putative methylation substrates on the functions of pUL69, we constructed various pUL69 derivatives harboring arginine-to-alanine substitutions and tested them for RNA export activity. Thus, we were able to discriminate between arginines within the R1 box of pUL69 that were crucial for UAP56/PRMT6-interaction and/or mRNA export activity. Remarkably, nuclear magnetic resonance (NMR) analyses revealed the same α-helical structures for pUL69 sequences encoding either the wild type R1/R2 boxes or a UAP56/PRMT6 binding-deficient derivative, thereby excluding the possibility that R/A amino acid substitutions within R1 affected the secondary structure of pUL69. We therefore conclude that the pUL69 N terminus is methylated by PRMT6 and that this critically affects the functions of pUL69 for efficient mRNA export and replication of human cytomegalovirus. IMPORTANCE: The UL69 protein of human cytomegalovirus is a multifunctional regulatory protein that acts as a viral RNA export factor with a critical role for efficient replication. Here, we demonstrate that pUL69 is posttranslationally modified via arginine methylation and that the protein methyltransferase PRMT6 mediates this modification. Furthermore, arginine residues with a crucial function for RNA export and for binding of the cellular RNA export factor UAP56 as well as PRMT6 were mapped within the arginine-rich R1 motif of pUL69. Importantly, we demonstrated that mutation of those arginines did not alter the secondary structure of R1, suggesting that they may serve as critical methylation substrates. In summary, our study reveals a novel posttranslational modification of pUL69 which has a significant impact on the function of this important viral regulatory protein. Since PRMTs appear to be amenable to selective inhibition by small molecules, this may constitute a novel target for antiviral therapy.