均質な硫化物と硫酸タンパク質：生化学機能に対するチロシン硫酸化の効果を特徴付ける合成アプローチとアプリケーション

タンパク質の翻訳後修飾は、構造、安定性、局在化、および機能を調節する上で重要な役割を果たします。スルホチロシン（STYR）を形成するためのチロシン残基のフェノール副鎖の硫酸化は、細胞外および不可欠な膜タンパク質の広範な修飾であり、細胞接着、血液凝固、炎症反応、および病原体感染におけるこれらのタンパク質の活性に影響を与えます。チロシン硫酸化は一般に、チロシン残基のクラスターを含む配列で発生し、各部位で不完全であり、硫黄の不均一な混合物をもたらします。個々の硫黄の精製は通常、実用的ではありません。したがって、各部位で硫酸化の影響を解明する最も有望なアプローチは、均一に硫酸化タンパク質（またはペプチド）を合成的に調製することです。この説明は、このような合成アプローチの開発と、結果として生じる硫化物と硫酸タンパク質の応用の両方における最近の進歩について、チロシン硫酸の機能的結果を特徴付けることについて説明しています。初期の合成研究では、FMOCベースのSPPS条件に耐えることができるように、サイドチェーン硫酸エステルが保護されたカセットベースの固相ペプチド合成（SPPS）アプローチを使用しました。その後、同じペプチドの複数のスルホフォームへの効率的なアクセスの必要性に対処するために、直交する側鎖保護チロシン残基を利用した分岐した固相合成アプローチを開発しました。この方法を使用して、特定の配列内で最大3つのチロシン残基の直交脱保護と硫酸化を実施し、単一の固相合成から特定の標的の8つの硫黄すべてにアクセスできるようにしました。均一に硫酸化ペプチドを手にして、生化学機能に対するチロシン硫酸化の影響を調べることができました。これらの研究のいくつかは、白血球の人身売買と炎症の重要なメディエーターであるケモカイン受容体の硫酸化断片に焦点を当てていました。受容体CCR3については、チロシン硫酸化がケモカインリガンドへの結合の親和性と選択性を高めることを示し、NMR分光法によるこれらの親和性向上の構造的基礎を決定しました。CCR5硫化物のライブラリーを使用して、HIV-1感染をサポートするために、ある特定の部位で硫酸化の重要な重要性を実証しました。小さなペプチドに加えて、均質にチロシン硫酸タンパク質を産生する可能性を実証する可能性を実証し、チロシン硫酸化とグリコシル化の両方を含むヒル由来の抗血栓性タンパク質Hirudin P6を合成するためにSPPと天然の化学的ライゲーション法を使用しました。硫酸化はトロンビンに対する阻害活性を大幅に促進しましたが、硫酸化タンパク質へのグリカンの添加は阻害を減少させ、異なる翻訳後修飾間の機能的相互作用を示しています。さらに、ライゲーションアプローチの成功は、インテインベースの技術を使用して、合成硫化物の発現タンパク質とのライゲーションによって、より大きな硫酸タンパク質が得られる可能性があることを示唆しています。

Post-translational modification of proteins plays critical roles in regulating structure, stability, localization, and function. Sulfation of the phenolic side chain of tyrosine residues to form sulfotyrosine (sTyr) is a widespread modification of extracellular and integral membrane proteins, influencing the activities of these proteins in cellular adhesion, blood clotting, inflammatory responses, and pathogen infection. Tyrosine sulfation commonly occurs in sequences containing clusters of tyrosine residues and is incomplete at each site, resulting in heterogeneous mixtures of sulfoforms. Purification of individual sulfoforms is typically impractical. Therefore, the most promising approach to elucidate the influence of sulfation at each site is to prepare homogeneously sulfated proteins (or peptides) synthetically. This Account describes our recent progress in both development of such synthetic approaches and application of the resulting sulfopeptides and sulfoproteins to characterize the functional consequences of tyrosine sulfation. Initial synthetic studies used a cassette-based solid-phase peptide synthesis (SPPS) approach in which the side chain sulfate ester was protected to enable it to withstand Fmoc-based SPPS conditions. Subsequently, to address the need for efficient access to multiple sulfoforms of the same peptide, we developed a divergent solid-phase synthetic approach utilizing orthogonally side chain protected tyrosine residues. Using this methodology, we have carried out orthogonal deprotection and sulfation of up to three tyrosine residues within a given sequence, allowing access to all eight sulfoforms of a given target from a single solid-phase synthesis. With homogeneously sulfated peptides in hand, we have been able to probe the influence of tyrosine sulfation on biochemical function. Several of these studies focused on sulfated fragments of chemokine receptors, key mediators of leukocyte trafficking and inflammation. For the receptor CCR3, we showed that tyrosine sulfation enhances affinity and selectivity for binding to chemokine ligands, and we determined the structural basis of these affinity enhancements by NMR spectroscopy. Using a library of CCR5 sulfopeptides, we demonstrated the critical importance of sulfation at one specific site for supporting HIV-1 infection. Demonstrating the feasibility of producing homogeneously tyrosine-sulfated proteins, in addition to smaller peptides, we have used SPPS and native chemical ligation methods to synthesize the leech-derived antithrombotic protein hirudin P6, containing both tyrosine sulfation and glycosylation. Sulfation greatly enhanced inhibitory activity against thrombin, whereas addition of glycans to the sulfated protein decreased inhibition, indicating functional interplay between different post-translational modifications. In addition, the success of the ligation approach suggests that larger sulfoproteins could potentially be obtained by ligation of synthetic sulfopeptides to expressed proteins, using intein-based technology.