インスリン応答性アミノペプチダーゼ（IRAP）のS-アシル化：修飾システインの定量的分析と同定

インスリン応答性アミノペプチダーゼ（IRAP）は、最近、脂肪細胞および他の組織のS-アシル化タンパク質として同定されました。ただし、現在、このタンパク質のS-アシル化の程度、修飾された残基、またはIRAP局在に対するS-アシル化の影響に関する情報はありません。この研究では、半定量的アシル-RAC技術を採用して、IRAPの約60％が3T3-L1脂肪細胞でS-アシル化されていることを示します。対照的に、IRAPと広範囲に共局在するグルコース輸送体であるGLUT4のS-アシル化は、約5倍低かった。IRAPのS-アシル化の部位を2つのシステイン残基にマッピングするために、部位指向の突然変異誘発を採用しました。そのうちの1つは、単一膜貫通ドメインの細胞質側にあると予測されています。我々の結果は、これらのシステインが相互に独占的に修正される可能性があることを示唆しています。S-アシル化はいくつかの膜貫通タンパク質の細胞内輸送を調節しますが、HEK293T細胞におけるIRAPの原形質膜局在に対する修飾システインを変異させる効果は検出されず、S-アシル化はIRAPの動きに不可欠ではないことを示唆しています。分泌経路。

The insulin-responsive aminopeptidase (IRAP) was recently identified as an S-acylated protein in adipocytes and other tissues. However, there is currently no information on the extent of S-acylation of this protein, the residues that are modified, or the effects of S-acylation on IRAP localisation. In this study, we employ a semi-quantitative acyl-RAC technique to show that approximately 60% of IRAP is S-acylated in 3T3-L1 adipocytes. In contrast, S-acylation of GLUT4, a glucose transporter that extensively co-localises with IRAP, was approximately five-fold lower. Site-directed mutagenesis was employed to map the sites of S-acylation on IRAP to two cysteine residues, one of which is predicted to lie in the cytoplasmic side of the single transmembrane domain and the other which is just upstream of this transmembrane domain; our results suggest that these cysteines may be modified in a mutually-exclusive manner. Although S-acylation regulates the intracellular trafficking of several transmembrane proteins, we did not detect any effects of mutating the modified cysteines on the plasma membrane localisation of IRAP in HEK293T cells, suggesting that S-acylation is not essential for the movement of IRAP through the secretory pathway.