PHIC31インテグラゼ媒介遺伝子送達により、牛乳中のヒト血清アルブミンを高度に発現するトランスジェニック牛の産生

牛乳に高レベルの組換えヒト血清アルブミン（HSA）を発現するトランスジェニック牛は、商業生産の代替源として可能になります。私たちの目的は、PHIC31インテグレーゼ系と体細胞核移植（SCNT）を使用して、牛乳中のHSAを高度に発現するトランスジェニック牛を生産することでした。PHIC31インテグラゼのATTB認識部位を含む乳腺特異的発現プラスミドPiach（ - ）を、ウシ胎児線維芽細胞（BFF）にインテグレーゼ発現プラスミドPCMVINTと同時トランスフェクトしました。BFFのゲノムにおけるPHIC31インテグラゼを介した統合は、ネストされた逆PCRによってスクリーニングされました。PCR産物の配列の分析後、両方のATTBゲノム接合部位（ATTLとATTR）の46.0％（23/50）が確認され、4つの擬似ATTPサイトが特定されました。BF3、BF11、BF19、およびBF4のサイトの統合率は、それぞれ4.0％（2/50）、6.0％（3/50）、16.0％（8/50）および20.0％（10/50）でした。BF3は、ウシ染色体3コラーゲンアルファ3（VI）鎖2遺伝子にあり、他の3つの部位は非コード領域にあります。BF11、BF19およびBF4部位のトランスジェニック細胞株は、SCNTのドナーとして使用されました。トランスジェニック細胞BF19から2つの子牛が生まれ、1つは出生後数時間以内に死亡し、もう1つの子牛は健康で生き残った。PCRおよびサザンブロット分析により、クローン化された子牛のゲノムに導入遺伝子が統合されたことが明らかになりました。ネストされた逆PCRは、クローン化された子牛の統合部位がドナー細胞と同一であることを確認しました。ウエスタンブロッティング評価は、組換えHSAがトランスジェニック牛の牛乳で発現し、発現レベルが約4〜8 mg/mlであることを示しました。本研究は、PHIC31インテグレーゼシステムがHSAトランスジェニック牛を生産するための効率的かつ安全性遺伝子送達ツールであることを実証しました。牛の牛乳中の組換えHSAの生産は、大規模で費用対効果の高い資源を提供する可能性があります。

Transgenic cattle expressing high levels of recombinant human serum albumin (HSA) in their milk may as an alternative source for commercial production. Our objective was to produce transgenic cattle highly expressing HSA in milk by using phiC31 integrase system and somatic cell nuclear transfer (SCNT). The mammary-specific expression plasmid pIACH(-), containing the attB recognition site for phiC31 integrase, were co-transfected with integrase expression plasmid pCMVInt into bovine fetal fibroblast cells (BFFs). PhiC31 integrase-mediated integrations in genome of BFFs were screened by nested inverse PCR. After analysis of sequence of the PCR products, 46.0% (23/50) of the both attB-genome junction sites (attL and attR) were confirmed, and four pseudo attP sites were identified. The integration rates in BF3, BF11, BF19 and BF4 sites were 4.0% (2/50), 6.0% (3/50), 16.0% (8/50) and 20.0% (10/50), respectively. BF3 is located in the bovine chromosome 3 collagen alpha-3 (VI) chain isomer 2 gene, while the other three sites are located in the non-coding region. The transgenic cell lines from BF11, BF19 and BF4 sites were used as donors for SCNT. Two calves from transgenic cells BF19 were born, one died within a few hours after birth, and another calf survived healthy. PCR and Southern blot analysis revealed integration of the transgene in the genome of cloned calves. The nested reverse PCR confirmed that the integration site in cloned calves was identical to the donor cells. The western blotting assessment indicated that recombinant HSA was expressed in the milk of transgenic cattle and the expression level was about 4-8 mg/mL. The present study demonstrated that phiC31 integrase system was an efficient and safety gene delivery tool for producing HSA transgenic cattle. The production of recombinant HSA in the milk of cattle may provide a large-scale and cost-effective resource.