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背景：抗結核（TB）薬に対する結核菌の耐性は、標的遺伝子における自発的な染色体変異のためにほぼ排他的です。第一選択および第二行の両方の抗TB薬に対する薬剤耐性の迅速な検出は、結核制御プログラムの重要な要素となっています。特定の核酸配列の迅速で費用対効果が高く、高スループット検出を可能にする技術が必要です。この研究は、対立遺伝子特異的プライマー拡張（ASPE）およびMagplex-TAGミクロスフェアに基づくハイスループットアッセイを開発して、抗TB薬物耐性変異を検出することでした。 方法：357 M.結核臨床分離株とH37RVのDNAサンプルは、4つのプライマーセットを使用して多重PCRによって増幅され、23 TAG-ASPEプライマーを使用した多重ASPEが続きました。製品はTag-Aspeアレイでソートされ、Luminex XMAPシステムを使用して検出されました。遺伝子型もシーケンスによって決定されました。 結果：TAG-ASPE法による遺伝的薬物感受性タイピングは、シーケンスによって得られたものと100％一致していました。参照法としての表現型薬物感受性検査（DST）と比較して、TAG-Aspe法の感度と特異性は、イソニアジドの83％（95％信頼区間[CI]、79-88％）および97％（95％CI、90-100％）でした。リファンピン検査では、感度と特異性は90％（95％CI、86-93％）および100％（95％CI、99-100％）でした。また、エタンブトールの感度と特異性は58％（95％CI、51-65％）、86％（95％CI、79-93％）でした。 結論：この研究は、TAG-ASPE法が非常に再現性があり、費用対効果が高く、ハイスループットの臨床ジェノタイピングアプリケーションに適していることを実証しました。
背景：抗結核（TB）薬に対する結核菌の耐性は、標的遺伝子における自発的な染色体変異のためにほぼ排他的です。第一選択および第二行の両方の抗TB薬に対する薬剤耐性の迅速な検出は、結核制御プログラムの重要な要素となっています。特定の核酸配列の迅速で費用対効果が高く、高スループット検出を可能にする技術が必要です。この研究は、対立遺伝子特異的プライマー拡張（ASPE）およびMagplex-TAGミクロスフェアに基づくハイスループットアッセイを開発して、抗TB薬物耐性変異を検出することでした。 方法：357 M.結核臨床分離株とH37RVのDNAサンプルは、4つのプライマーセットを使用して多重PCRによって増幅され、23 TAG-ASPEプライマーを使用した多重ASPEが続きました。製品はTag-Aspeアレイでソートされ、Luminex XMAPシステムを使用して検出されました。遺伝子型もシーケンスによって決定されました。 結果：TAG-ASPE法による遺伝的薬物感受性タイピングは、シーケンスによって得られたものと100％一致していました。参照法としての表現型薬物感受性検査（DST）と比較して、TAG-Aspe法の感度と特異性は、イソニアジドの83％（95％信頼区間[CI]、79-88％）および97％（95％CI、90-100％）でした。リファンピン検査では、感度と特異性は90％（95％CI、86-93％）および100％（95％CI、99-100％）でした。また、エタンブトールの感度と特異性は58％（95％CI、51-65％）、86％（95％CI、79-93％）でした。 結論：この研究は、TAG-ASPE法が非常に再現性があり、費用対効果が高く、ハイスループットの臨床ジェノタイピングアプリケーションに適していることを実証しました。
BACKGROUND: Resistance of Mycobacterium tuberculosis to anti-tuberculosis (TB) drugs is almost exclusively due to spontaneous chromosomal mutations in target genes. Rapid detection of drug resistance to both first- and second-line anti-TB drugs has become a key component of TB control programs. Technologies that allow rapid, cost-effective, and high-throughput detection of specific nucleic acid sequences are needed. This study was to develop a high-throughput assay based on allele-specific primer extension (ASPE) and MagPlex-TAG microspheres to detect anti-TB drug resistance mutations. METHODS: DNA samples from 357 M. tuberculosis clinical isolates and H37Rv were amplified by multiplex PCR using four primer sets, followed by multiplex ASPE using 23 TAG-ASPE primers. The products were sorted on the TAG-ASPE array and detected by using the Luminex xMAP system. Genotypes were also determined by sequencing. RESULTS: Genetic drug susceptibility typing by the TAG-ASPE method was 100% concordant with those obtained by sequencing. Compared with phenotypic drug susceptibility testing (DST) as a reference method, the sensitivity and specificity of the TAG-ASPE method were 83% (95% confidence interval [CI], 79-88%) and 97% (95% CI, 90-100%) for isoniazid. For rifampin testing, the sensitivity and specificity were 90% (95% CI, 86-93%) and 100% (95% CI, 99-100%). Also, the sensitivity and specificity were 58% (95% CI, 51-65%) and 86% (95% CI, 79-93%) for ethambutol. CONCLUSIONS: This study demonstrated the TAG-ASPE method is suitable for highly reproducible, cost-effective, and high-throughput clinical genotyping applications.
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