MTTアッセイの落とし穴：阻害剤の直接および標的オフ効果は、細胞生存率の過剰/過小評価をもたらす可能性があります

MTTアッセイ（より少ないMTS、XTT、またはWST）は、細胞生存率/薬物細胞毒性を測定するための広く搾取されたアプローチです。MTTの減少は細胞全体で発生し、代謝やエネルギーの摂動、酸化還元酵素の活性の変化、エンド/エキソサイトーシス、細胞内の人身売買など、多くの要因によって大きな影響を受ける可能性があります。MTTアッセイによる細胞生存率の過剰/過小評価は、薬物治療媒介ストレスを介した細胞の適応代謝とミトコンドリアの再プログラミングと阻害剤のオフターゲット効果の両方に起因する可能性があります。以前は、イマチニブ、ロットレリン、ウルソール酸、ベラパミル、レスベラトロール、ゲニステインナノ粒子、およびいくつかのポリペプチドは、MTTアッセイと代替アッセイの間に一貫性のない結果をもたらすMTT還元率を妨げることが示されていました。ここでは、MTTアッセイによる生存率の下/過大評価をテストするために、Glioblastoma U251、T98G、およびC6細胞の治療後、MT​​Tアッセイから派生した結果をトリパンブルー除外アッセイと比較しました。エネルギーおよび代謝性恒常性への影響 - テモゾロミド（TMZ）、DNAメチル化剤、テムシロリムス（TEM）、MTORキナーゼの阻害剤、およびMEK1/2キナーゼの阻害剤であるU0126。阻害剤は、IC50の評価研究のように、または薬剤耐性の獲得に焦点を当てた研究のようにまもなく適用されました。MTTアッセイによる細胞生存率の過剰/過小評価とその有意性は、細胞株、生存率測定の時点、およびその他の実験パラメーターに依存することを示しました。さらに、MTTアッセイで考慮すべき要因の包括的な調査を提供しました。結果の誤解を避けるために、テトラゾリウム塩ベースのアッセイを他の非代謝アッセイで補充することをお勧めします。

The MTT assay (to a less degree MTS, XTT or WST) is a widely exploited approach for measuring cell viability/drug cytotoxicity. MTT reduction occurs throughout a cell and can be significantly affected by a number of factors, including metabolic and energy perturbations, changes in the activity of oxidoreductases, endo-/exocytosis and intracellular trafficking. Over/underestimation of cell viability by the MTT assay may be due to both adaptive metabolic and mitochondrial reprogramming of cells subjected to drug treatment-mediated stress and inhibitor off-target effects. Previously, imatinib, rottlerin, ursolic acid, verapamil, resveratrol, genistein nanoparticles and some polypeptides were shown to interfere with MTT reduction rate resulting in inconsistent results between the MTT assay and alternative assays. Here, to test the under/overestimation of viability by the MTT assay, we compared results derived from the MTT assay with the trypan blue exclusion assay after treatment of glioblastoma U251, T98G and C6 cells with three widely used inhibitors with the known direct and side effects on energy and metabolic homeostasis - temozolomide (TMZ), a DNA-methylating agent, temsirolimus (TEM), an inhibitor of mTOR kinase, and U0126, an inhibitor of MEK1/2 kinases. Inhibitors were applied shortly as in IC50 evaluating studies or long as in studies focusing on drug resistance acquisition. We showed that over/underestimation of cell viability by the MTT assay and its significance depends on a cell line, a time point of viability measurement and other experimental parameters. Furthermore, we provided a comprehensive survey of factors that should be accounted in the MTT assay. To avoid result misinterpretation, supplementation of the tetrazolium salt-based assays with other non-metabolic assays is recommended.