分裂酵母における単一段階の薬剤耐性とプロト栄養マーカースイッチングのための新しいカセット

タンパク質の局在化、存在量、タンパク質間相互作用をテストするために、複数のオープンリーディングフレームで異なるエピトープタグを運ぶ遺伝的相互作用分析のための増加変異株の構築は、十分な数の異なる選択可能なマーカーの利用可能性によって妨げられます。さらに、単一の遺伝子削除またはタグを持つひずみは、株コレクションにすでに存在することがよくあります。歴史的な理由から、これらは主にURA4（+）遺伝子またはG418耐性KANMXをマーカーとして運びます。同じマーカーを使用してマルチ削除またはタグ付けされたひずみを生成するか、異なるマーカーで特定のひずみを完全に再構築することはかなり面倒であるため、マーカーのシングルステップ交換プロトコルは時間を節約する選択肢です。近年、Clonnat、Hygromycin BおよびBleomycinに対するドミナント薬物耐性マーカー（DDRM）が、Schizosaccharomyces Pombeで適応し、うまく使用されています。対応するDDRMカセット、NATMX、HPHMX、およびBLEMXは、Ashbya gossypiiのTEFプロモーターとターミネーターシーケンスをKANMXとして運びます。これにより、相同遺伝子ターゲティングによる単一ステップマーカースワッピングを可能にするための隣接するホモロジーが提供されます。この非常に有用なツールセットをシングルステップマーカー交換に拡張するために、栄養マーカーArg3（+）、His3（+）、Leu1（+）、およびUra4（+）を含むMXカセットを構築しました。さらに、kanmx6、natmx4、およびhphmx4とのura4（+）の単一ステップ交換を可能にするために、一連のコンストラクトが作成されました。カセットの機能は、いくつかの遺伝子座でのシングルステップマーカースワッピングを成功させることによって実証されています。これらのコンストラクトにより、既存のURA4（+）およびMX削除およびタグ付き株の簡単かつ迅速な発言が可能になります。

Construction of multiply mutated strains for genetic interaction analysis and of strains carrying different epitope tags at multiple open reading frames for testing protein localization, abundance and protein-protein interactions is hampered by the availability of a sufficient number of different selectable markers. Moreover, strains with single gene deletions or tags often already exist in strain collections; for historical reasons these will mostly carry the ura4(+) gene or the G418-resistance kanMX as marker. Because it is rather cumbersome to produce multiply deleted or tagged strains using the same marker, or to completely reconstruct a particular strain with a different marker, single-step exchange protocols of markers are a time-saving alternative. In recent years, dominant drug resistance markers (DDRMs) against clonNAT, hygromycin B and bleomycin have been adapted and successfully used in Schizosaccharomyces pombe. The corresponding DDRM cassettes, natMX, hphMX and bleMX, carry the TEF promotor and terminator sequences from Ashbya gossypii as kanMX; this provides flanking homologies to enable single-step marker swapping by homologous gene targeting. To expand this very useful toolset for single-step marker exchange, I constructed MX cassettes containing the nutritional markers arg3(+), his3(+), leu1(+) and ura4(+). Furthermore, a set of constructs was created to enable single-step exchange of ura4(+) to kanMX6, natMX4 and hphMX4. The functionality of the cassettes is demonstrated by successful single-step marker swapping at several loci. These constructs allow straightforward and rapid remarking of existing ura4(+) - and MX-deleted and -tagged strains.