反応性代謝物の検出のための、非常に敏感で選択的な新規トラッピング試薬、安定同位体標識グルタチオンエチルエステルの特性評価

はじめに：グルタチオン（GSH）トラッピングアッセイは、製薬業界における特異な薬物反応（IDR）の市販後リスクを予測するために広く使用されています。いくつかのGSH誘導体が反応性中間体のトラッピング試薬として導入されていますが、誤った結果の生成を防ぐために、より敏感で選択的な試薬が望まれます。この研究では、GSHエチルエステル（GSHEE-D5）という標識された安定同位体が設計され、その検出能力が評価されました。 方法：GSHEE-D5を合成し、その検出電位を参照トラッピング試薬としてGSH（[（13）C2、（15）n] GSH）と標識した安定同位体と比較しました。トラッピング試薬は、それぞれGSHEEまたはGSHとの1：1混合物としてヒト肝臓ミクロソームに加え、7つのIDR陽性薬物と3つのIDRネガティブ薬とインキュベートしました。試薬と反応性代謝物の間に形成された付加物は、中性損失フィルタリングを備えた同位体パターン依存スキャンを使用して、単位分解能質量分析計（MS）によって分析されました。 結果：GSHとエタノール-D6の単一ステップ反応により、GSHEE-D5が85％の収量を生成しました。GSHEE-D5アッセイは、7つのIDR陽性薬物すべてを含む付加物を検出し、3つのIDR陰性薬物では付加物は検出されませんでした。対照的に、[（13）C2、（15）n] GSHアッセイは、3つのIDR陽性薬物で付加物を検出できませんでした。ジクロフェナクの場合、GSHEE-D5アッセイは[（13）C2、（15）n] GSHアッセイよりも4倍の信号強度を示しました。 議論：GSHEE-D5は、[（13）C2、（15）n] GSHよりも感度と選択性の高い反応性代謝物の検出を可能にしました。これらの結果は、GSHEE-D5がユニット解像度MSを使用してIDRのリスクを評価するための有用なトラップ試薬であることを示しています。

INTRODUCTION: Glutathione (GSH) trapping assays are widely used to predict the post-marketing risk for idiosyncratic drug reactions (IDRs) in the pharmaceutical industry. Although several GSH derivatives have been introduced as trapping reagents for reactive intermediates, more sensitive and selective reagents are desired to prevent the generation of erroneous results. In this study, stable isotope labeled GSH ethyl ester (GSHEE-d5) was designed and its detection capability was evaluated. METHODS: GSHEE-d5 was synthesized and its detection potential was compared with stable isotope labeled GSH ([(13)C2,(15)N]GSH) as a reference trapping reagent. The trapping reagents were added to human liver microsomes as a 1:1 mixture with GSHEE or GSH, respectively, and incubated with seven IDR positive drugs and three IDR negative drugs. The adducts formed between the reagents and reactive metabolites were analyzed by unit resolution mass spectrometer (MS) using isotope pattern-dependent scan with neutral loss filtering. RESULTS: A single-step reaction of GSH and ethanol-d6 produced GSHEE-d5 with a yield of 85%. The GSHEE-d5 assay detected adducts with all seven IDR positive drugs, and no adducts were detected with the three IDR negative drugs. In contrast, the [(13)C2,(15)N]GSH assay failed to detect adducts with three of the IDR positive drugs. In the case of diclofenac, the GSHEE-d5 assay showed a 4-times greater signal intensity than the [(13)C2,(15)N]GSH assay. DISCUSSION: GSHEE-d5 enabled the detection of reactive metabolites with greater sensitivity and selectivity than [(13)C2,(15)N]GSH. These results demonstrate that GSHEE-d5 would be a useful trapping reagent for evaluating the risk of IDRs with unit resolution MS.