[RFP-GFP-LC3を安定に発現するRAW2647細胞株の確立]

目的：マウスマクロファージを確立するためにRAW264.7細胞株は、赤蛍光タンパク質緑色の蛍光タンパク質 - マクロチューブ関連タンパク質光鎖3（RFP-GFP-LC3）の安定した発現を伴う。 方法：RFP-GFP-LC3遺伝子を含むレンチウイルスベクターを構築し、包装プラスミドとともにHEK293T細胞にパッケージ化しました。ウイルス上清を収集して、RAW264.7細胞に感染しました。RFP-GFP-LC3の安定した発現を伴うRAW264.7細胞株をプロマイシンでスクリーニングし、感染効率のためにフローサイトメトリーと蛍光顕微鏡で分析しました。RFP-GFP-LC3 Punctaの数は、飢ation治療後の蛍光顕微鏡検査を使用して観察されました。 結果：組換えレンチウイルスPLV-CMV-RFP-GFP-LC3が正常に構築されました。RFP-GFP-LC3の安定した発現を伴うRAW264.7細胞は、ウイルス感染とプロマイシンスクリーニングによって得られました。蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーは、RFPとGFPの発現率が100％に達したことを示しました。オートファジー涙点の数は、飢starch治療後に大幅に増加しました。 結論：RFP-GFP-LC3の安定した発現を伴うRAW264.7細胞ひずみが正常に構築されており、オートファジー研究のための信頼できるセルラープラットフォームを提供します。

OBJECTIVE: To establish murine macrophage RAW264.7 cell strain with stable expression of red fluorescent protein-green fluorescent protein-microtubule associated protein light chain 3 (RFP-GFP-LC3). METHODS: A lentiviral vector containing RFP-GFP-LC3 gene was constructed and then packaged in HEK293T cells with the packaging plasmids. The viral supernatant was collected to infect RAW264.7 cells. The RAW264.7 cell strain with stable expression of RFP-GFP-LC3 was screened with puromycin and analyzed with flow cytometry and fluorescent microscopy for infection efficiency. The number of RFP-GFP-LC3 puncta was observed using florescence microscopy following starvation treatment. RESULTS: The recombinant lentivirus pLV-CMV-RFP-GFP-LC3 was successfully constructed. The RAW264.7 cells with stable expression of RFP-GFP-LC3 were obtained by viral infection and puromycin screening. Fluorescent microscopy and flow cytometry demonstrated the expression rates of RFP and GFP reached to 100%. The number of autophagic puncta significantly increased after starvation treatment. CONCLUSION: The RAW264.7 cell strain with stable expression of RFP-GFP-LC3 has been successfully constructed, which provides a reliable cellular platform for autophagy research.