Miseqイルミナプラットフォームでの微生物群集分析のための拡張シングルインデックス多重化16S RRNAシーケンス

イルミナプラットフォームを使用した微生物群集分析のためのプライマリ16S RRNAシーケンスプロトコルには、各シーケンス実行で数百のサンプルのプーリングを可能にする単一インデックスアプローチが含まれています。プロトコルは、150 bpペアの端（PE）シーケンスを使用して、16S rRNAのV4過可視領域（HVR）をターゲットにします。ただし、Illumina Chemistryの最新の改善により、300 bp PEシーケンスを使用して読み取り長が600 bpに増加しました。読み取りの長さを長く利用するために、異なるHVRをターゲットにするためにデュアルインデックスアプローチが以前に開発されました。ただし、単純な作業プロトコルのため、シングルインデックス150 bp PEアプローチは、多くの研究者にとって依然として魅力的です。ここでは、16S RRNAのV3-V4 HVRを標的とする300 bp PEイルミナシーケンスの拡張シングルインデックスプロトコルについて説明しました。新しいプライマーセットは、読み取り長とアライメント解像度の増加、およびV4シーケンスの150 bp PEプロトコルから得られたものと比較して、結果として生じる微生物プロファイルの豊かさと多様性を増加させました。また、β-ダイバーシティプロファイルは、2つのアプローチ間で定性的かつ定量的に異なっていました。両方のプライマーセットには、優性門を検出するための高いカバレッジ率と特異性がありました。ただし、まれな生物圏に関するカバレッジ率はさまざまでした。私たちのデータはさらに、プライマーの選択がカバレッジと特異性のシーケンスにおける最も決定論的な要因であることを確認します。

The primary 16S rRNA sequencing protocol for microbial community analysis using Illumina platforms includes a single-indexing approach that allows pooling of hundreds of samples in each sequencing run. The protocol targets the V4 hypervariable region (HVR) of 16S rRNA using 150 bp paired-end (PE) sequencing. However, the latest improvement in Illumina chemistry has increased the read length up to 600 bp using 300 bp PE sequencing. To take advantage of the longer read length, a dual-indexing approach was previously developed for targeting different HVRs. However, due to simple working protocols, the single-index 150 bp PE approach still continues to be attractive to many researchers. Here, we described an extended single-indexing protocol for 300 bp PE illumina sequencing that targets the V3-V4 HVRs of 16S rRNA. The new primer set led to increased read length and alignment resolution, as well as increased richness and diversity of resulting microbial profile compared to that obtained from150 bp PE protocol for V4 sequencing. The β-diversity profile also differed qualitatively and quantitatively between the two approaches. Both primer sets had high coverage rates and specificity to detect dominant phyla; however, their coverage rate with regards to the rare biosphere varied. Our data further confirms that the choice of primer is the most deterministic factor in sequencing coverage and specificity.