フルオレセインベースのOrac（酸素ラジカル吸収能力）アッセイにおけるアルコキシルラジカルの役割

過去数十年にわたって、ポリフェノールが豊富な果物、野菜、飲み物のin vitro抗酸化能力を評価するために、Orac（酸素ラジカル吸光度）アッセイが広く採用されてきました。この方法は、標的分子としてフルオレセイン（FLH）を、ペルオキシルラジカルの供給源としてAAPH（2,2'-azo-bis（2-アミジノプロパン）ジヒドロ塩酸塩）として使用します（Roo•）。抗酸化物質（XH）によって与えられるFLHの保護は、しばしばXH-ROO•反応の化学量論（N）に直接関連するクリアラグ時間（LT）を持つ運動プロファイルによって特徴付けられます。ただし、単純なフェノール化合物であっても、LTは、単純な反応メカニズムでは説明できない大きなN値（各抗酸化分子に閉じ込められたROの数として定義される）を意味します。それにもかかわらず、2つのAAPH由来ROOの組換えからのアルコキシルラジカル（RO•）の形成を考慮すると、それらを説明できます。現在の作業では、FLH消費のゼロ順序運動限界では、ROOの総トラップと互換性が低い低い反応速度があることを示す速度論的データを提供します。したがって、FLHの消費は、主にRO•との反応に関連する必要があります。さらに、競合測定では、LTはROOの効率的なトラップによるものであるという仮定に関するデータを提示します。これらの値は、HPLC-dad技術によって実行されるAAPHの存在によって媒介される抗酸化剤消費の運動学的研究と一致していません。これは、RO•による競争を意味します。結果は、低濃度でのプローブとしてのFLHの使用により、いくつかの抗酸化物質に対して、主にROラジカルに対するRoラジカルに対する反応に関連するORAC値が得られることを示唆しています。

During the last decades the ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) assay has been widely employed to evaluate the in vitro antioxidant capacity of polyphenol-rich fruits, vegetables and beverages. The method employs fluorescein (FLH) as target molecule and AAPH (2,2'-azo-bis(2-amidinopropane)dihydrochloride) as the source of peroxyl radicals (ROO•). The protection of FLH, afforded by antioxidants (XH), is often characterized by kinetic profiles with clear lag times (LT), which are directly associated with the stoichiometry (n) of the XH-ROO• reaction. However, even for simple phenolic compounds, the LT measured imply large n values (defined as the number of ROO• moles trapped by each antioxidant molecule) which cannot be explained by a simple reaction mechanism. Nonetheless, they can be explained when considering the formation of alkoxyl radicals (RO•) from the recombination of two AAPH-derived ROO•. In the present work, we provide kinetic data showing that, in the zero order kinetic limit of FLH consumption, there is a low reaction rate incompatible with total trapping of ROO•. Thus, the consumption of FLH should be mostly related to its reaction with RO•. In addition, we present data regarding the assumption that in competitive measurements, the LT is due to efficient trapping of the ROO• by the added phenols, leading to high n values (1.7 to 23) for mono and polyphenols. These values are not in agreement with kinetic studies of the antioxidant consumption mediated by the presence of AAPH carried out by HPLC-DAD technique, which imply a competition by RO•. The results suggest that the use of FLH as probe at low concentrations give, for several antioxidants, ORAC values mainly related to their reaction towards RO• radicals instead of primary ROO•radicals.