ビオチン標識Phos-Tagによるホスホペプチド検出

プロテインキナーゼは、創薬および疾患の診断とその予後の評価のための非常に貴重な標的酵素であると広く考えられています。したがって、細胞プロテインキナーゼの活性を測定するための効果的な分析技術は、リンプロテオミクスの分野での研究に必要です。最近、プロテインキナーゼの活性を追跡するための非常に敏感なマイクロアレイベースの技術を開発しました。さまざまなプロテインキナーゼの特異的基質である一連のペプチドは、ガラススライドに固定され、細胞溶解物によってリン酸化されます。さまざまなペプチドの得られたリン酸化型は、リン酸結合タグ分子であるビオチン標識Phos-tagを使用して、西洋ワラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンに結合したビオチン標識Phos-tagを使用して、選択的かつ同時に検出されます。自動画像アナライザーを使用して、強化された化学発光信号を容易に検出できます。この章では、ビオチン標識Phos-Tagによるホスホペプチドを検出するための標準的なプロトコルについて説明します。また、細胞内プロテインキナーゼ活性のハイスループットプロファイリングのためのマイクロアレイシステムについても説明します。PHOS-TAGベースの方法は、細胞シグナル伝達イベントに関与するリン酸化反応の複雑な範囲の迅速な検出に役立つと予想され、キナーゼ活性化因子または阻害剤のハイスループットスクリーニングに潜在的な用途があります。

Protein kinases are widely considered to be invaluable target enzymes for drug discovery and for diagnosing diseases and assessing their prognosis. Effective analytical techniques for measuring the activities of cellular protein kinases are therefore required for studies in the field of phosphoproteomics. We have recently developed a highly sensitive microarray-based technique for tracing the activities of protein kinases. A series of peptides that are specific substrates of various protein kinases are immobilized on a glass slide and subjected to phosphorylation by cell lysates. The resulting phosphorylated forms of the various peptides are then selectively and simultaneously detected by using a phosphate-binding tag molecule, biotin-labeled Phos-tag, bound to horseradish peroxidase-conjugated streptavidin. Enhanced chemiluminescence signals can then be readily detected by using an automatic image analyzer. In this chapter, we describe a standard protocol for detecting phosphopeptides by biotin-labeled Phos-tag. We also describe a microarray system for high-throughput profiling of intracellular protein kinase activities. The Phos-tag-based method is expected to be useful in the rapid detection of the complex range of phosphorylation reactions involved in cellular signaling events, and it has potential applications in high-throughput screening of kinase activators or inhibitors.