in vitroアッセイにおけるトリプトファンとその代謝物の抗酸化特性の評価

背景：母乳には、乳児の成長と発達に重要な役割を果たす多くの栄養素と生物活性成分が含まれています。ヒューマルクの重要な栄養素と生物活性成分の1つは、L-トリプトファンです。L-トリプトファンは、不可欠な芳香族α-アミノ酸であり、小児と成人の食事に必要です。必須アミノ酸として、タンパク質合成には、およびセロトニン、メラトニン、トリプタミン、ナイアシン、キノリン酸、キヌレン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドなどの重要な生体分子の前駆体として必要です。この研究の目的は、ヒト牛乳とその代謝物から分離されたトリプトファンの抗酸化、抗炎症、および抗炎症性の特性を、ヒト神経膠腫U251細胞の代謝産物から分離し、トリプトファンの分子イオンに対するヒト再生（HRIFNγ）の効果を評価することでした。ヒトグリアU251細胞の代謝産物。 方法：細胞毒性は、MTT（3-（4、5-ジメチルチアゾリル-2）-2、5-ジフェニルテトラゾリウム）アッセイによって決定されました。抗酸化特性は、酸素ラジカル除去能力（ORAC）法によって評価されました。抗炎症効果は、サイトカインIL-6およびTNF-αに対する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって決定されました。トリプトファンとその代謝の分子イオンに対する組換えヒト（RHIFNγ）の効果は、質量分析によって評価されました。トリプトファンは、酵素消化後の乳ペプチドから分離され、その後クロマトグラフィーおよび質量分析法による分離が続きました。 結果：母乳からのトリプトファンは、全牛乳（80.4±13.3 µm TE/g）よりも、酸素ラジカル吸収能力（7,986±468 µMトロロックス等価（TE）/g）を示しました。トリプトファンは、TNF-αおよびIL-6に対して中程度の抗炎症活性を示しました。RHIFNγはトリプトファン代謝を阻害しました。低濃度のL-トリプトファン（10-25μg/mL）は、細胞の成長のほぼ25％を阻害しました。U251細胞を25μg/mL L-トリプトファンで処理し、その後30 ng/mlのヒト組換えIFNγで課題にした場合、細胞成長に対する有意な阻害効果が観察されました。低濃度のキサンスレン酸、L-キヌレニン、および3-OH DLキヌレニンは、メラトニンと3-OHアントラニル酸を除く細胞成長を阻害することがわかりました。メラトニンは生細胞でのTNF-αの強力な誘導因子でしたが、25、50、100 µg/mLの3-OHキヌレニンは、生細胞でIL-6を阻害しました。10 µg/mLのL-キヌレニンが炎症性サイトカインIL-8を有意に高レベルで生成したことを除いて、トリプトファン処理U251細胞ではIL-8プロファイルで有意な変化は観察されませんでした。メラトニン、3-OH、高濃度（100 µg/mL）のDLキヌレニンは、U251細胞の増殖を誘導しました。メラトニンは、ヒト神経膠腫細胞の成長を促進する際に、組換えヒトIFNγ（Rhinfγ）と相乗効果を示しているように見えました。トリプトファン単独でU251細胞を治療し、その後のRHIFNγで治療することで、ヒト癌神経膠腫細胞の成長を阻害し、逆にRHIFNγと組み合わせたメラトニンはU251細胞の成長を促進しました。 結論：この研究の結果は、母乳由来のトリプトファンとその代謝産物が強力な抗酸化特性を持っていることを示唆しています。このような効果は、濃度依存的にヒト癌細胞の細胞増殖と成長を調節する上で重要な役割を果たす可能性があります。

BACKGROUND: Human milk contains a number of nutrients and bioactive ingredients which play an important role in the growth and development of infants. One important nutrient and bioactive ingredient of human milk is L-tryptophan. L-Tryptophan is an essential aromatic α-amino acid and is required in the diet of children and adult humans. As an essential amino acid, it is needed for protein synthesis and as a precursor of key biomolecules such as serotonin, melatonin, tryptamine, niacin, quinolinic acid and kynurenic acid, nicotinamide adenine dinucleotide. The aim of the study was to evaluate the antioxidant, anti-inflammatory and antiproliferative properties of tryptophan isolated from enzymatic hydrolysates from human milk and its metabolites on human glioma U251 cells and to evaluate the effects of human recombinant (hrIFNγ) on molecular ions of tryptophan and its metabolites in human glial U251 cells. METHODS: The cytotoxicity was determined by MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay. The antioxidant property was assessed by the oxygen radical scavenging capacity (ORAC) method. The anti-inflammatory effect was determined by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) against cytokines IL-6 and TNF-α. The effects of recombinant human (rhIFNγ) on molecular ions of tryptophan and its catabolites were evaluated by mass spectrometry. The tryptophan was isolated from milk peptides following enzymatic digestion, followed by separation by chromatographic and mass spectrometric methods. RESULTS: Tryptophan from human milk exhibited profoundly higher oxygen radical absorption capacity (7,986±468 µm Trolox equivalent (TE)/g) than that of whole human milk (80.4±13.3 µm TE/g). Tryptophan showed a moderate degree of anti-inflammatory activity against TNF-α and IL-6. rhIFNγ inhibited tryptophan metabolism. A low concentration of L-tryptophan (10-25 μg/mL) inhibited nearly 25% of cell growth. When U251 cells were treated with 25 μg/mL L-tryptophan and subsequently challenged with 30 ng/mL of human recombinant IFNγ, a significant inhibitory effect on cell growth was observed. Low concentrations of Xanthurenic acid, L-kynurenine, and 3-OH DL kynurenine were found to inhibit cell growth except melatonin and 3-OH anthranilic acid. Melatonin was a strong inducer of TNF-α in RAW cells, whereas 3-OH kynurenine at 25, 50 and 100 µg/mL inhibited IL-6 in RAW cells. No significant change was observed in the IL-8 profile in tryptophan-treated U251 cells except that L-kynurenine at 10 µg/mL produced significantly high level of an inflammatory cytokine IL-8. Melatonin, 3-OH, DL kynurenine at high concentrations (100 µg/mL) induced proliferation of U251 cells. Melatonin seemed to show synergistic effects with recombinant human IFNγ (rhINFγ) in promoting growth of human glioma cells. While treatment of U251 cells with tryptophan alone and subsequent treatment with rhIFNγ inhibited the growth of human cancer glioma cells, and conversely melatonin combined with rhIFNγ promoted growth of the U251 cells. CONCLUSIONS: The findings from this study suggest that human milk-derived tryptophan and its metabolites possess strong antioxidant properties. Such effects might play a significant role in regulating the cell proliferation and growth of human cancer cells in a concentration-dependent manner.