グリコシル化およびアグリコシル化ヒトカルボキシレステラーゼの構造と活性の比較1

ヒトカルボキシルエステラーゼ1（HCES1）は、さまざまな臨床薬の解毒と代謝の原因となる重要な肝臓ミクロソーム酵素です。アスパラギン79をグルタミンに変異させることによって生成される酵素の構造と活性、本物のグリコシル化HCES1およびアグリコシル化HCES1に対する単一N結合グリカンの役割を分析するために、ヒト胚性腎細胞で生成されました。精製された酵素は、分析的超遠心分離により、主に溶液中の三量体であることが示されました。精製されたアグリコシル化酵素は、グリコシル化HCES1よりも活性であることがわかっており、酵素速度論の分析により、両方の酵素が陽性協同性を示すことが明らかになりました。HCES1の結晶構造1触媒的に不活性変異体（S221A）およびアグリコシル化酵素は、高分解能（それぞれ1.86Å、1.48Åおよび2.01Å）のリガンドまたは基質がない場合に決定されました。3つの構造すべての重ね合わせは、すべてのCα位置にわたって約0.5Åの根平均平方根偏差を持つわずかな立体構造の違いのみを示しました。これらの非リガンド酵素の活性部位をHCES1-リガンド複合体の構造と比較すると、触媒トライアドの側鎖が基質結合のために事前に分散していることが示されました。全体的な結果は、HCES1のN-グリコシル化の防止が酵素の構造または活性に有意に影響しないことを示しています。

Human Carboxylesterase 1 (hCES1) is the key liver microsomal enzyme responsible for detoxification and metabolism of a variety of clinical drugs. To analyse the role of the single N-linked glycan on the structure and activity of the enzyme, authentically glycosylated and aglycosylated hCES1, generated by mutating asparagine 79 to glutamine, were produced in human embryonic kidney cells. Purified enzymes were shown to be predominantly trimeric in solution by analytical ultracentrifugation. The purified aglycosylated enzyme was found to be more active than glycosylated hCES1 and analysis of enzyme kinetics revealed that both enzymes exhibit positive cooperativity. Crystal structures of hCES1 a catalytically inactive mutant (S221A) and the aglycosylated enzyme were determined in the absence of any ligand or substrate to high resolutions (1.86 Å, 1.48 Å and 2.01 Å, respectively). Superposition of all three structures showed only minor conformational differences with a root mean square deviations of around 0.5 Å over all Cα positions. Comparison of the active sites of these un-liganded enzymes with the structures of hCES1-ligand complexes showed that side-chains of the catalytic triad were pre-disposed for substrate binding. Overall the results indicate that preventing N-glycosylation of hCES1 does not significantly affect the structure or activity of the enzyme.