組み合わせDRE組換え戦略のための新しいヘテロタイプROX部位

CREなどの部位特異的リコンビナーゼ（SSR）は、細胞標識と操作のための遺伝子標的と遺伝的アプローチで広く使用されています。専用の認識部位で2つのDNA分子間のDNA鎖交換を媒介します。LOXPターゲットサイトにおける個々の塩基対の役割を含むCRE組換えメカニズムの正確な理解は、野生型LOXPではなく、特異的にそれ自体と再結合しない変異LOX部位の生成を導きました。これにより、マルチカラー記者、不可逆的な反転、組換え媒介カセット交換など、さまざまな組み合わせCRE依存性の遺伝的戦略が開発されました。ROXP部位を認識するCRE関連ファージインテグラゼであるDREは、CRE-LOXPシステムと交差することはありませんが、同様の組換え効率を持っています。以前に、DREとCREを組み合わせた交差遺伝的戦略について説明しました。現在、自己認識に重要なROXP塩基対を特定することを目的とした変異誘発スクリーンを報告しています。ROXPと互換性がないが、精製されたシステムまたは細菌および真核組織培養システムのいずれかで自分自身で効率的に再結合することができるいくつかのRoxバリアントサイトについて説明します。これらの新たに特定されたROXサイトはCREによって認識されないため、複数のLOXPおよびROXPバリアントを含むCRE、DRE、およびターゲットの遺伝子座を含む潜在的な組み合わせ戦略を可能にします。

Site-specific recombinases (SSRs) such as Cre are widely used in gene targeting and genetic approaches for cell labeling and manipulation. They mediate DNA strand exchange between two DNA molecules at dedicated recognition sites. Precise understanding of the Cre recombination mechanism, including the role of individual base pairs in its loxP target site, guided the generation of mutant lox sites that specifically recombine with themselves but not with the wild type loxP. This has led to the development of a variety of combinatorial Cre-dependent genetic strategies, such as multicolor reporters, irreversible inversions, or recombination-mediated cassette exchange. Dre, a Cre-related phage integrase that recognizes roxP sites, does not cross-react with the Cre-loxP system, but has similar recombination efficiency. We have previously described intersectional genetic strategies combining Dre and Cre. We now report a mutagenesis screen aimed at identifying roxP base pairs critical for self-recognition. We describe several rox variant sites that are incompatible with roxP, but are able to efficiently recombine with themselves in either purified systems or bacterial and eukaryotic tissue culture systems. These newly identified rox sites are not recognized by Cre, thus enabling potential combinatorial strategies involving Cre, Dre, and target loci including multiple loxP and roxP variants.