カルベノキソロンは、最初の細胞外ループでの相互作用を通じてパネキシン1チャネルを阻害します

Pannexin1（Panx1）は、免疫応答とシナプス強度を制御するために重要なATP放出チャネルです。C末端切断、高濃度の細胞外カリウム、および電圧を含むさまざまな刺激が実証されており、PANX1を活性化しています。ただし、PANX1がこのような多様な刺激をどのように感知して統合してオープンチャネルを形成するかは不明のままです。PANX1チャネルゲーティングの根底にあるメカニズムに関する手がかりを提供するために、広範囲の刺激によって引き起こされるPANX1機能を減衰させるために最も一般的に使用される小分子であるカルベノキソロン（CBX）の作用メカニズムを調査しました。キメラアプローチを使用して、CBXが作用極性を逆転させ、最初の細胞外ループのW74が非芳香族残基に変異したときにPanx1の電圧依存チャネル活性を増強することを発見しました。系統的変異誘発研究により、このループ内の保存された残基も、CBX結合を媒介することにより、CBX機能に重要な役割を果たしていることが明らかになりました。プロベネシドやATPなどの他のPANX1阻害剤に実験を拡張しました。これは、位置74でPANX1変異体の電圧依存性チャネル活性を増強します。これらのデータは、プロベネシドを含むCBXおよび他の阻害剤が、最初の細胞外ループの変調を通じてPANX1チャネル活性を減衰させることを示唆しています。私たちの実験は、CBXアクションの以前は未知のモードを特定するための最初のステップであり、PANX1チャネルゲーティングにおける最初の細胞外ループの役割についての洞察を提供します。

Pannexin1 (Panx1) is an ATP release channel important for controlling immune responses and synaptic strength. Various stimuli including C-terminal cleavage, a high concentration of extracellular potassium, and voltage have been demonstrated to activate Panx1. However, it remains unclear how Panx1 senses and integrates such diverse stimuli to form an open channel. To provide a clue on the mechanism underlying Panx1 channel gating, we investigated the action mechanism of carbenoxolone (CBX), the most commonly used small molecule for attenuating Panx1 function triggered by a wide range of stimuli. Using a chimeric approach, we discovered that CBX reverses its action polarity and potentiates the voltage-gated channel activity of Panx1 when W74 in the first extracellular loop is mutated to a nonaromatic residue. A systematic mutagenesis study revealed that conserved residues in this loop also play important roles in CBX function, potentially by mediating CBX binding. We extended our experiments to other Panx1 inhibitors such as probenecid and ATP, which also potentiate the voltage-gated channel activity of a Panx1 mutant at position 74. Notably, probenecid alone can activate this mutant at a resting membrane potential. These data suggest that CBX and other inhibitors, including probenecid, attenuate Panx1 channel activity through modulation of the first extracellular loop. Our experiments are the first step toward identifying a previously unknown mode of CBX action, which provide insight into the role of the first extracellular loop in Panx1 channel gating.