ナノ流体リアルタイムPCRシステムを使用したヒト病原性ウイルスの分子検出のための新しいハイスループット法

人間の腸内ウイルスは、世界中の食物疾患および水媒介性疾患の主な原因として認識されています。ヒト腸ウイルスの敏感で定量的な検出は、通常、定量的RT-PCR（RT-QPCR）を通じて達成されます。ナノ流体リアルタイムPCRシステムを使用して、定性的分子検出（RT-QPCRアレイ）の新しいハイスループット法を開発し、デジタルRT-PCR（RT-DPCR）によるヒト病原性ウイルスの定量化を行いました。ハイスループットPCRメソッドのパフォーマンスは、19のヒト病原性ウイルスと食物ウイルス学で使用される2つの主要なプロセスコントロールを検出するために調査されました。従来のリアルタイムPCRシステムは、RT-DPCRおよびRT-QPCRアレイと比較されました。分光光度測定によって計算されたゲノムコピーの数に基づいて、0.3〜1.6のlog10の因子範囲で14ウイルスのRT-DPCRよりもRT-QPCRよりも感度がわずかに優れていることがわかりました。逆に、0.10から1.40 LOG10の因子範囲による7つのウイルスのRT-QPCRよりもRT-DPCRの方が感度が向上しました。興味深いことに、RT-DPCRによって決定されるゲノムコピーの数は、RT-QPCR標準曲線によって計算された予想コピー数よりも常に1〜2 Log10が低かったです。RT-QPCRおよびRT-QPCRアレイアッセイの感度は、2つのウイルスで類似しており、RT-QPCRの場合はRT-QPCRアレイの方が、0.7〜3.0のlog10の因子範囲による18のウイルスの場合よりも優れていることがわかりました。逆に、感度は、ノロウイルスGIV検出のための従来のRT-QPCRアッセイよりも、RT-QPCRアレイの方が0.30 log10のみでした。最後に、RT-QPCRアレイとRT-DPCRアッセイは、臨床サンプルをスクリーニングし、病原性ウイルスを定量化するために一緒に使用されました。さらに、この方法により、臨床サンプルの共感染を特定することが可能になりました。結論として、多数のウイルスターゲットの速さと可能性を考えると、このナノ流体RT-QPCRアッセイは、人間の病原性ウイルス監視と発生調査に大きな影響を与えるはずであり、公衆衛生に利益をもたらす可能性があります。

Human enteric viruses are recognized as the main causes of food- and waterborne diseases worldwide. Sensitive and quantitative detection of human enteric viruses is typically achieved through quantitative RT-PCR (RT-qPCR). A nanofluidic real-time PCR system was used to develop novel high-throughput methods for qualitative molecular detection (RT-qPCR array) and quantification of human pathogenic viruses by digital RT-PCR (RT-dPCR). The performance of high-throughput PCR methods was investigated for detecting 19 human pathogenic viruses and two main process controls used in food virology. The conventional real-time PCR system was compared to the RT-dPCR and RT-qPCR array. Based on the number of genome copies calculated by spectrophotometry, sensitivity was found to be slightly better with RT-qPCR than with RT-dPCR for 14 viruses by a factor range of from 0.3 to 1.6 log10. Conversely, sensitivity was better with RT-dPCR than with RT-qPCR for seven viruses by a factor range of from 0.10 to 1.40 log10. Interestingly, the number of genome copies determined by RT-dPCR was always from 1 to 2 log10 lower than the expected copy number calculated by RT-qPCR standard curve. The sensitivity of the RT-qPCR and RT-qPCR array assays was found to be similar for two viruses, and better with RT-qPCR than with RT-qPCR array for eighteen viruses by a factor range of from 0.7 to 3.0 log10. Conversely, sensitivity was only 0.30 log10 better with the RT-qPCR array than with conventional RT-qPCR assays for norovirus GIV detection. Finally, the RT-qPCR array and RT-dPCR assays were successfully used together to screen clinical samples and quantify pathogenic viruses. Additionally, this method made it possible to identify co-infection in clinical samples. In conclusion, given the rapidity and potential for large numbers of viral targets, this nanofluidic RT-qPCR assay should have a major impact on human pathogenic virus surveillance and outbreak investigations and is likely to be of benefit to public health.