細胞内およびin vitroでのミクロシンE492アミロイド形成を調節する主要なアミノ酸残基の同定

マイクロシンE492（MCCE492）は、Klebsiella Pneumoniae Ryc492によって産生および輸出された細孔形成バクテリオシンです。抗菌活性に加えて、排泄されたMCCE492は、in vivoおよびin vitroでアミロイド線維を形成することができます。細菌のアミロイドは生物学的役割を果たす機能的であり、MCCE492の特定のケースでは抗菌活性を制御することが提案されています。MCCE492 in vitroでのアミロイドフィブリルの形態と形成速度論はよく特徴付けられていますが、他の細菌アミロイドについて報告されているように、どのアミノ酸残基がそのアミロイド生成傾向を決定するかも不明でもありません。この研究では、MCCE492が大腸菌細胞で細胞内アミロイドを形成する条件を発見しました。これは、2-4'-メチルアミノフェニルベンゾチアゾールとチオフラビン-Sを2つのアミロイドフィリックプローブによって認識された丸い形の包有物として視覚化されました。この特性を使用して、フローサイトメトリーベースのアッセイを実行して、推定凝集ホットスポットのシリコ予測を使用して設計されたMCCE492変異体の凝集傾向を評価しました。予測されたアミノ酸残基54-63が、アミノイド誘発性の伸びとして効果的に機能することを確立しました。他のアミロイド形成タンパク質の場合と同様に、この領域は2つのゲートキーパー残基（p57およびp59）を提示しました。これは、細胞内およびin vitro MCCE492の両方のアミロイド形成の両方を好み、制御されていない凝集を防ぎます。これらのゲートキーパー残基のそれぞれの変異体は、in vitroでの凝集と菌類の不活性化動態をより速く示し、2つの変異体は、これらの変異体を発現する大腸菌細胞の80％以上で密なアミロイド包含物として蓄積されました。対照的に、残基54-63を欠いているMCCE492変異体は、細胞内凝集傾向が有意に低く、in vitro重合動力学が遅くなりました。これらの変異体によってin vitroで形成されたアミロイドの電子顕微鏡分析により、効率は異なりますが、すべてが野生型MCCE492と形態学的に類似していることが明らかになりました。MCCE492細胞内アミロイド形成の生理学的意味は、おそらく細胞外アミロイドで観察される不活性化プロセスに類似しており、このバクテリオシンが大量に産生されると、細胞内の潜在的に毒性のある種を隔離する平均として使用できます。

Microcin E492 (MccE492) is a pore-forming bacteriocin produced and exported by Klebsiella pneumoniae RYC492. Besides its antibacterial activity, excreted MccE492 can form amyloid fibrils in vivo as well as in vitro. It has been proposed that bacterial amyloids can be functional playing a biological role, and in the particular case of MccE492 it would control the antibacterial activity. MccE492 amyloid fibril's morphology and formation kinetics in vitro have been well-characterized, however, it is not known which amino acid residues determine its amyloidogenic propensity, nor if it forms intracellular amyloid inclusions as has been reported for other bacterial amyloids. In this work we found the conditions in which MccE492 forms intracellular amyloids in Escherichia coli cells, that were visualized as round-shaped inclusion bodies recognized by two amyloidophilic probes, 2-4'-methylaminophenyl benzothiazole and thioflavin-S. We used this property to perform a flow cytometry-based assay to evaluate the aggregation propensity of MccE492 mutants, that were designed using an in silico prediction of putative aggregation hotspots. We established that the predicted amino acid residues 54-63, effectively act as a pro-amyloidogenic stretch. As in the case of other amyloidogenic proteins, this region presented two gatekeeper residues (P57 and P59), which disfavor both intracellular and in vitro MccE492 amyloid formation, preventing an uncontrolled aggregation. Mutants in each of these gatekeeper residues showed faster in vitro aggregation and bactericidal inactivation kinetics, and the two mutants were accumulated as dense amyloid inclusions in more than 80% of E. coli cells expressing these variants. In contrast, the MccE492 mutant lacking residues 54-63 showed a significantly lower intracellular aggregation propensity and slower in vitro polymerization kinetics. Electron microscopy analysis of the amyloids formed in vitro by these mutants revealed that, although with different efficiency, all formed fibrils morphologically similar to wild-type MccE492. The physiological implication of MccE492 intracellular amyloid formation is probably similar to the inactivation process observed for extracellular amyloids, and could be used as a mean of sequestering potentially toxic species inside the cell when this bacteriocin is produced in large amounts.