単一分子イメージングは、一本鎖DNA結合タンパク質によるEXO1調節のメカニズムを明らかにします

エキソヌクレアーゼ1（EXO1）は、5 '→3'エキソヌクレアーゼと5'-FLAPエンドヌクレアーゼであり、複数の真核生物DNA修復経路で重要な役割を果たします。DNAニックと二本鎖切断でのEXO1処理は、複製タンパク質A（RPA）および他の単一鎖DNA結合タンパク質（SSB）に急速に結合する一本鎖DNAの長いストレッチを作成します。ここでは、単一分子蛍光イメージングと定量的細胞生物学的アプローチを使用して、EXO1とSSBの間の相互作用を明らかにします。ヒトと酵母の両方のEXO1は、単独でのプロセスヌクレアーゼです。RPAはDNAからEXO1を急速に取り除き、この活性は少なくとも3つのRPAエンコードの一本鎖DNA結合ドメインに依存しています。さらに、ヒト細胞におけるRPAのアブレーションが、損傷部位へのEXO1の動員を増加させることを示しています。対照的に、一本鎖DNA複合体1-Aのセンサーは、EXO1による相同組換えサポートプロセス切除中にDNA切除を促進するヒトSSBを最近同定しました。RPAはEXO1を急速に操作しますが、同じDNA部位でのヌクレアーゼリバインディングの複数サイクルは、限られたDNA処理をサポートできます。これらの結果は、真核細胞のDNA修復中にEXO1がどのように調節されるかに影響を与え、Exo1触媒切断切除を制御する際の一本鎖DNA結合タンパク質の役割を明らかにしています。

Exonuclease 1 (Exo1) is a 5'→3' exonuclease and 5'-flap endonuclease that plays a critical role in multiple eukaryotic DNA repair pathways. Exo1 processing at DNA nicks and double-strand breaks creates long stretches of single-stranded DNA, which are rapidly bound by replication protein A (RPA) and other single-stranded DNA binding proteins (SSBs). Here, we use single-molecule fluorescence imaging and quantitative cell biology approaches to reveal the interplay between Exo1 and SSBs. Both human and yeast Exo1 are processive nucleases on their own. RPA rapidly strips Exo1 from DNA, and this activity is dependent on at least three RPA-encoded single-stranded DNA binding domains. Furthermore, we show that ablation of RPA in human cells increases Exo1 recruitment to damage sites. In contrast, the sensor of single-stranded DNA complex 1-a recently identified human SSB that promotes DNA resection during homologous recombination-supports processive resection by Exo1. Although RPA rapidly turns over Exo1, multiple cycles of nuclease rebinding at the same DNA site can still support limited DNA processing. These results reveal the role of single-stranded DNA binding proteins in controlling Exo1-catalyzed resection with implications for how Exo1 is regulated during DNA repair in eukaryotic cells.