ゼブラフィッシュの発達段階に関するQRT-PCR正規化に適した新しい参照遺伝子の識別

QRT-PCRデータの正規化に使用される参照遺伝子は、遺伝子発現分析の精度に重要です。ただし、ゼブラフィッシュの初期発達で使用される多くの従来の参照遺伝子は、胚形成中のさまざまな発現レベルのために適切ではありません。本研究では、以前のRNA-seqデータセットを使用して、ゼブラフィッシュの初期発達段階での遺伝子発現分析に適した新しい参照遺伝子を特定しました。最初に、最大値と最小RPKM値の比率に応じて、RNA-Seqデータセット（合計29,291遺伝子）から197の最も安定して発現した遺伝子を選択しました。197の遺伝子のうち、中程度の発現レベルと9つの発生段階を通じて最小変動を持つ4つの遺伝子が候補参照遺伝子として特定されました。4つの独立した統計アルゴリズム（Delta-CT、Genorm、BestKeeper、Normfinder）を使用して、これらの候補のQRT-PCR発現の安定性を評価し、ActB1およびActB2の安定性と比較して、2つの一般的に使用されるゼブラフィッシュ参照遺伝子と比較しました。安定性のランキングは、ほとんどの場合、MOBK13（MOB4）とLSM12Bの2つの遺伝子がACTB1およびACTB2よりも安定していることを示しました。MobK13およびLSM12Bの新規参照遺伝子としての適合性をさらにテストするために、それらは3つのよく研究された標的遺伝子を正常化するために使用されました。結果は、ゼブラフィッシュの初期発達に関して、MOBK13およびLSM12BがACTB1およびACTB2よりも適切であることを示しました。胚形成および初期幼虫期のゼブラフィッシュQRT-PCR分析のための新しい最適な参照遺伝子として、MOBK13およびLSM12Bを推奨します。

Reference genes used in normalizing qRT-PCR data are critical for the accuracy of gene expression analysis. However, many traditional reference genes used in zebrafish early development are not appropriate because of their variable expression levels during embryogenesis. In the present study, we used our previous RNA-Seq dataset to identify novel reference genes suitable for gene expression analysis during zebrafish early developmental stages. We first selected 197 most stably expressed genes from an RNA-Seq dataset (29,291 genes in total), according to the ratio of their maximum to minimum RPKM values. Among the 197 genes, 4 genes with moderate expression levels and the least variation throughout 9 developmental stages were identified as candidate reference genes. Using four independent statistical algorithms (delta-CT, geNorm, BestKeeper and NormFinder), the stability of qRT-PCR expression of these candidates was then evaluated and compared to that of actb1 and actb2, two commonly used zebrafish reference genes. Stability rankings showed that two genes, namely mobk13 (mob4) and lsm12b, were more stable than actb1 and actb2 in most cases. To further test the suitability of mobk13 and lsm12b as novel reference genes, they were used to normalize three well-studied target genes. The results showed that mobk13 and lsm12b were more suitable than actb1 and actb2 with respect to zebrafish early development. We recommend mobk13 and lsm12b as new optimal reference genes for zebrafish qRT-PCR analysis during embryogenesis and early larval stages.